DkHB4调控‘磨盘柿’果实采后软化的机制研究

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柿果实采后极易软化,过度或快速的软化不利于采后贮藏,直接影响其流通和商品价值,因此果实软化始终是柿采后研究的重要课题之一。本文以‘磨盘柿’(Diospyros kaki.cv.Mopanshi)为实验材料,采用乙烯处理,利用RNA-Seq,通过基因克隆、实时荧光定量PCR、烟草双荧光素酶、酵母双杂交、BiFC等技术体系、亚细胞定位等,鉴别了受乙烯处理诱导的转录因子,并进一步明确其靶标基因,初步探索这些基因之间的作用机制。主要研究结果如下:  1.柿果实后熟软化相关基因的克隆与表达分析。依据RNA-Seq结果,筛选得到受乙烯处理诱导的转录因子和结构基因,并利用RACE技术获得了30个转录因子和13个结构基因的编码基因序列。利用实时荧光定量PCR(Q-PCR),验证了其中27个转录因子和10个结构基因的表达在乙烯处理后快速软化的果实中显著上调。  2.响应乙烯处理的转录因子对细胞壁降解相关基因的作用效应分析。通过烟草双荧光素酶体系,鉴别到DkHB4、DkGATA3、DkWRKY12、DkNAC22能显著激活涩柿果实采后软化相关DkXTH9和DkPE9的启动子活性。点突变实验结果表明,DkHB4、DkGATA3、DkWRKY12均能直接结合DkXTH9启动子,DkNAC22能直接结合DkPE9启动子。  3.DkHB4与DkERFs的协同调控效应分析。进一步选择DkHB4为主要研究对象,分析了它与DkERFs的协同调控效应。烟草双荧光素酶体系研究发现DkHB4与DkERF8、DkERF16和DkERF19混合,均可显著提升对DkXTH9启动子的诱导效应。酵母双杂交和BiFC实验结果均表明DkHB4与DkERF16存在蛋白互作关系,但DkHB4与DkERF8和DkERF19并没有直接的蛋白互作关系。  综上所述,本论文克隆了受乙烯诱导的‘磨盘柿’果实转录因子及细胞壁降解基因,发现了多个调控细胞壁降解基因的转录因子,其中DkHB4既可直接结合DkXTH9的启动子,还可通过与DkERF16蛋白互作协同调控DkXTH9启动子。这些结果进一步丰富了乙烯加速柿果实后熟软化的转录调控机制。
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