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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科,其基因组为单股正链RNA,易变异,慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌,危害患者的健康和生命,已成为严重的社会和公共卫生问题。目前尚无有效的HCV相关疫苗上市。长期以来,由于HCV的RNA聚合酶高变异性及包膜蛋白的中和抗原位点高度变异,使以体液免疫为主的预防性丙肝疫苗的研究进展缓慢。据研究表明,细胞免疫反应可能不仅能清除HCV病毒,还能预防机体再次感染。因此,研制既能诱导细胞免疫亦能诱导体液免疫的预防和治疗性HCV疫苗便成了当务之急。本研究以HCV核心蛋白Core、非结构蛋白NS3及NS4B为目的基因,构建核酸疫苗,以期为HCV疫苗的应用研究提供参考。主要研究结果如下:1.丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建采用RT-PCR扩增丙型肝炎病毒(HCV)2a型JFH1株核心蛋白Core基因、非结构蛋白NS3及NS4B基因与pVAX1连接,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pVAX1-Core、pVAX1-NS3、pVAX1-NS4B 及能表达 Core 基因、NS3 基因和 NS4B 基因融合蛋白的重组质粒pVAX1-Core-NS3-NS4B。对上述4种重组质粒进行PCR和酶切鉴定后,分别以脂质体转染法转染HepG2细胞,采用RT-PCR检测Core、NS3、NS4B及融合蛋白的mRNA在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了 HCV的4种重组质粒,且能够在HepG2细胞中得到表达。真核表达质粒pVAX1-Core、pVAX1-NS3、pVAX1-NS4B 和 pVAX1-Core-NS3-NS4B 的成功构建为进一步研究丙型肝炎核酸疫苗奠定了基础。2.丙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫研究将重组质粒 pVAX1-Core、pVAX1-NS3、pVAX1-NS4B 及 pVAX1-NS3-Core-NS4B以肌肉注射方式分组对BALB/c小鼠进行3次免疫(100μg/只),分别在首次免疫和加强免疫后第2周分别进行眼球采血,分离收集血清冻存备用;于末次免疫后第2周处死小鼠、采集全血及血清冻存。采用流式细胞术检测外周血中T淋巴细胞亚群变化;采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测小鼠血清中IgG抗体水平及IL-2、IL-4、IFN-y等细胞因子的分泌水平;采用荧光定量PCR检测血清阻断病毒感染情况。流式细胞术检测结果显示,3次免疫后外周血中T淋巴细胞类型中CD3+、CD4++CD8+、CD4+细胞数量,pVAX1-NS3-Core-NS4B组高于对照组,有极显著差异(P<0.01);pVAX1-NS4B组和pVAX1-Core组高于对照组,显著性差异(P<0.05)。ELISA检测结果显示,3次免疫后小鼠血清中总IgG水平,pVAX1-NS3组、pVAX1-NS4B组均高于对照组,有极显著差异(P<0.01);血清中IL4水平,pVAX1-Core组高于对照组,有极显著差异(P<0.01);血清中IL2水平,pVAX1-NS3组高于对照组,有极显著差异(P<0.01);血清中 IFN-γ 水平,pVAX1-NS3-Core-NS4B、pVAX1-NS3、pVAX1-NS4B 和pVAX1-Core四个组均高于对照组,有极显著差异(P<0.01)。荧光定量结果显示,与对照组相比,pVAX1-NS3组病毒载量降低,有极显著性差异(P<0.01),pVAX1-NS4B组和pVAX1-Core组病毒载量降低,差异呈显著性(P<0.05)。在3次免疫过程中,pVAX1-Core、pVAX1-NS3、pVAX1-NS4B均能诱导体液免疫和持续的细胞免疫应,pVAX1-NS3-Core-NS4B主要体现在诱导持续的细胞免疫应答,这将为丙肝核酸疫苗的免疫研究与应用提供依据。