【摘 要】
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茶黄素是一种重要的功能性成分,具有抗氧化衰老、降血糖血脂、抗菌抗癌等多种功能。目前,茶黄素的合成制备主要利用红茶传统发酵工艺,但产物的产率不高、纯度较低、成本难以控制,其原因在于红茶内多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)的酶活力较低且酶促合成茶黄素(Theaflavins,TFs)的能力不强。PPO能有效催化茶多酚等酚类物质氧化聚合生成醌类物质,在酶促合成TFs等方面有着重要
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茶黄素是一种重要的功能性成分,具有抗氧化衰老、降血糖血脂、抗菌抗癌等多种功能。目前,茶黄素的合成制备主要利用红茶传统发酵工艺,但产物的产率不高、纯度较低、成本难以控制,其原因在于红茶内多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)的酶活力较低且酶促合成茶黄素(Theaflavins,TFs)的能力不强。PPO能有效催化茶多酚等酚类物质氧化聚合生成醌类物质,在酶促合成TFs等方面有着重要作用。因此,若能筛选出酶促合成能力较强的植物外源PPO,将提高TFs的生成量,从而促进TFs相关药品和食品的开发利用。本研究以市面上分布广泛、价格适宜的果蔬作为酶源物分别提取其PPO粗酶和纯酶,通过对比其酶促合成TFs能力的差异,筛选出催化能力最强的PPO,研究其相关的酶学性质并优化酶促合成TFs的反应条件,主要结果如下:(1)通过匀浆浸提法得到马铃薯、红薯、芋头、山药、苹果、丰水梨、贡梨、香蕉、李子、青枣的PPO粗酶,其酶活力、比活力及酶促合成TFs的能力均存在显著性差异,并且初步筛选出马铃薯、红薯和山药作为酶促合成TFs的适宜酶源。(2)采用缓冲液匀浆浸提、硫酸铵盐析沉淀、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和浓缩等方法,分离纯化得到马铃薯、红薯和山药PPO,其比活力依次为731.95 U/mg、842.59 U/mg、688.08 U/mg;回收率依次为18.41%、17.94%、13.90%;纯化倍数依次为12.95、13.22、11.14;分子量依次为40 k Da、25 k Da、33k Da。(3)来自同一酶源的PPO粗酶和纯酶,其酶促合成TFs及各茶黄素单体的能力存在差异。当其单位酶活力相近时,酶促合成TFs的能力将随着比活力的提高而增强;而来自不同酶源物的PPO,在纯化倍数和比活力差异不大的情况下,酶促合成TFs的能力与PPO本身性质直接相关,因此选择酶促合成TFs能力最强的马铃薯作为最适宜的催化酶源。(4)不同酶源的PPO催化儿茶素类酶促生成各茶黄素单体的能力存在差异,即某一酶源PPO对某一类或几类茶黄素单体的酶促合成具有一定程度的定向性。(5)马铃薯PPO的相关酶学性质如下:等电点为5.97;最适p H为6.0,最适温度为30℃,在温度20~30℃和p H 5.0~6.0范围内,能够保持较好的热稳定性和酸碱稳定性。同时,金属离子Na+、K+和Ca2+对酶活力无较大影响,Al3+、Mg2+和Zn2+对酶活力有激活作用,Cu2+和Mn2+对酶活力存在抑制作用,且PPO具有较好的耐盐性。PPO与二酚类物质(邻苯二酚)的亲和能力最强,与二酚类物质(邻苯二酚、对苯二酚)和三酚类物质(焦性没食子酸)的亲和能力稍弱、而与单酚类物质(苯酚和愈创木酚)的亲和能力最弱。抗坏血酸、半胱氨酸和亚硫酸钠对PPO酶活力的抑制作用明显,而柠檬酸、草酸和EDTA-Na2对PPO酶活力的抑制作用随着抑制剂浓度的增加而增加。(6)以茶多酚作为反应底物,利用马铃薯PPO,优化得到酶促合成TFs的最适反应条件为:p H为5.5、反应时间为150 min、底物浓度为6.0 mg/m L、反应温度为20℃,此时TFs的生成量最高,其值为667.42μg/m L。同时,以不同的儿茶素单体作为反应底物,通过调控各儿茶素单体物质的量之比,将直接影响各茶黄素单体的定向合成。
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