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学习记忆障碍是一种常见的衰老相关退行性改变,其机制与突触的形态、功能以及突触可塑性的变化密切相关。环状RNA（Circular RNA,circ RNA）是一类新近发现的非编码RNA,在神经系统中表达丰富,在突触可塑性、学习和记忆中起着重要作用,但circ RNA在衰老相关学习记忆障碍中的功能及作用机制尚不明确。本课题组早期检测了小鼠海马的circ RNA表达谱,发现circ-Vps41可以提高核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）基因敲除小鼠的海马突触可塑性并改善学习记忆能力,由此我们推测circ-Vps41可能是衰老小鼠学习记忆形成的分子机制之一。目的:本实验通过研究circ-Vps41在衰老小鼠中的表达变化及作用机制,深入了解circ-Vps41的功能,为改善衰老所致学习记忆障碍提供思路。方法:1.在HT22衰老细胞模型中,检测circ-Vps41的表达变化。使用不同浓度（50 m M、75 m M、100 m M）的D-gal干预HT22细胞,CCK-8实验检测细胞代谢活性,β-半乳糖甘酶染色实验检测细胞衰老程度,选择最佳衰老造模时间和给药浓度,诱导建立衰老细胞模型。将HT22细胞分成2组:衰老细胞模型组（75 m M D-gal组）,空白对照组（control组）,q RT-PCR检测细胞中circ-Vps41的表达变化。2.在HT22衰老细胞模型中过表达circ-Vps41后,检测Syp、PSD95的表达变化。用lipo3000分别将Vector-circ-Vps41、Vector-NC转染至75 m M D-gal组、control组细胞中,共3组:control组细胞+空载体质粒（control+Vector-NC组）;HT22衰老细胞模型+空载体质粒（D-gal+Vector-NC组）;HT22衰老细胞模型+circ-Vps41过表达质粒（D-gal+Vector-circ-Vps41组）,用q RT-PCR技术检测circ-Vps41的过表达效率,Western Blot技术检测细胞中Syp、PSD95蛋白的表达变化。3.在衰老模型小鼠的海马中,检测circ-Vps41的表达变化。1.1自然衰老小鼠随机挑选老年和青年ICR小鼠,分为2组:老年组（Aged组）、青年组（Young组）,每组8只,两组小鼠适应性饲养7天后,应用新物体识别实验、水迷宫实验,测试衰老小鼠学习记忆能力的变化;采用q RT-PCR技术,检测海马circ-Vps41的表达变化。1.2 D-gal衰老模型小鼠ICR小鼠随机分成2组:对照组（control组）、D-gal给药组（D-gal组）,每组8只,使用新物体识别实验、水迷宫实验,测试D-gal衰老模型小鼠学习记忆能力的变化;采用q RT-PCR技术,检测海马circ-Vps41的表达变化。4.海马过表达circ-Vps41对D-gal衰老模型小鼠学习记忆能力的影响。使用脑立体定位技术将GFP腺相关病毒对照载体（AAV-GFP）和过表达circ-Vps41腺相关病毒载体（AAV-circ-Vps41）分别注射入小鼠海马CA1区。实验分为3组:control组小鼠+GFP腺相关病毒对照组（control+AAV-GFP组）、D-gal衰老模型小鼠+GFP腺相关病毒对照组（D-gal+AAV-GFP组）和D-gal衰老模型小鼠+过表达circ-Vps41腺相关病毒组（D-gal+AAV-circ-Vps41组）,每组8只,q RT-PCR检测circ-Vps41的过表达效率。使用新物体识别、水迷宫实验,检测衰老模型小鼠过表达circ-Vps41后学习记忆能力的变化。5.过表达circ-Vps41后,检测D-gal衰老模型小鼠海马中树突棘密度以及Syp、PSD95的表达变化。使用高尔基染色、免疫组织化学染色、Western Blot、q RT-PCR等技术,观察control+AAV-GFP组、D-gal+AAV-GFP组和D-gal+AAV-circ-Vps41组海马树突棘密度的变化,以及Syp、PSD95的表达变化。结果:1.HT22衰老细胞模型中,circ-Vps41的表达显著降低。CCK-8实验结果表明,不同浓度梯度的D-gal对HT22细胞生存率均有显著的抑制作用,随着浓度的升高,细胞生存率下降的趋势越明显,75m M和100 m M作用效果相似。与control组相比,75 m M组与100 m M组在给药第2天细胞生存率均显著下降。使用β-半乳糖苷酶染色实验进一步观察不同浓度D-gal在给药第2天的衰老细胞阳性率,结果表明,与control组相比,50 m M组衰老细胞阳性率无显著变化,75 m M组与100 m M组衰老细胞阳性率均显著升高。Western Blot结果表明,与control组相比,75 m M D-gal组Syp与PSD95蛋白表达均显著降低。选用75 m M D-gal处理HT22细胞2天建立细胞衰老模型。2.HT22衰老细胞模型中过表达circ-Vps41质粒后,Syp,PSD95表达显著升高。qRT-PCR结果表明,与control+Vector-NC组相比,D-gal+Vector-NC组circ Vps41表达显著下降,D-gal+Vector-circ-Vps41组circ Vps41表达显著升高;与D-gal+Vector-NC组相比,D-gal+Vector-circ-Vps41组circ Vps41表达显著升高。Western Blot结果表明,与control+Vector-NC组相比,D-gal+Vector-NC组Syp蛋白表达显著降低,D-gal+Vector-circ-Vps41组Syp蛋白表达显著升高;与D-gal+Vector-NC组相比,D-gal+Vector-circ-Vps41组Syp蛋白表达显著升高。与control+Vector-NC组相比,D-gal+Vector-NC组PSD95蛋白表达显著降低,D-gal+Vector-circ-Vps41组PSD95蛋白表达无显著变化;与D-gal+Vector-NC组相比,D-gal+Vector-circ-Vps41组PSD95蛋白表达显著升高。3.D-gal衰老模型小鼠海马组织中,circ-Vps41的表达显著降低。3.1自然衰老小鼠新物体识别实验结果表明,与Young组相比,Aged组在间隔2 h和24 h的测试中,对新物体的偏好程度无显著变化。水迷宫实验结果表明,与Young组相比,Aged组小鼠总路程、平均速度、潜伏期以及穿越平台次数均无显著变化。Western Blot结果表明,与Young组相比,Aged组小鼠海马PSD95蛋白表达显著降低,Syp蛋白表达无显著变化。q RT-PCR结果表明,与Young组相比,Aged组小鼠海马circ-Vps41的表达无显著变化。3.2 D-gal衰老模型小鼠新物体识别实验结果表明,与control组相比,D-gal组在间隔2 h和24 h的测试中,对新物体的偏好程度显著减少。水迷宫实验结果表明,与control组相比,D-gal组小鼠总路程和平均速度无显著变化;与control组相比,D-gal组小鼠的潜伏期在第3-5天时显著升高;与control组相比,D-gal组小鼠穿越平台次数显著减少。Western Blot结果显示,与control组相比,D-gal组小鼠海马Syp和PSD95蛋白的表达均显著降低。q RT-PCR结果表明,与control组相比,D-gal组小鼠海马circ-Vps41的表达显著降低。4.海马过表达circ-Vps41可改善D-gal衰老模型小鼠学习记忆障碍。使用q RT-PCR检测circ-Vps41的过表达效率,结果表明,D-gal+AAV-circ-Vps41组海马circ-Vps41的表达显著高于control+AAV-circ RNA NC组与D-gal+AAV-circ RNA NC组。新物体识别实验结果表明,在间隔2 h和24 h测试中,与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠对新物体的偏好程度均显著降低,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠对新物体的偏好程度均显著增加;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠对新物体的偏好程度显著升高;水迷宫实验中,control+AAV-circ RNA NC组小鼠与D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠的总路程和平均速度无显著变化;与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠第3-5天潜伏期显著升高,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠第5天潜伏期显著升高;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠的潜伏期在第4-5天时显著升高;与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠穿越平台次数显著减少,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠穿越平台次数显著减少;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠穿越平台次数显著增多。5.D-gal衰老模型小鼠海马组织中过表达circ-Vps41,可显著增加树突棘密度,并促进Syp和PSD95的表达。高尔基染色法检测海马CA1区树突棘密度结果显示,与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠树突棘密度显著降低,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠树突棘密度无显著变化;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠树突棘密度显著升高。Western Blot结果表明,与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠海马Syp的表达显著降低,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠海马Syp的表达显著降低;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠海马Syp的表达显著升高。与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组小鼠海马PSD95的表达显著降低,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠海马PSD95的表达显著降低;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组小鼠海马PSD95的表达显著增多。免疫组织化学染色结果,与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组海马CA1、CA3区Syp的表达均显著减少,D-gal+AAV-circ-Vps41组海马CA1、CA3区Syp的表达均显著降低;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组海马CA1、CA3区Syp的表达均显著增多。与control+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ RNA NC组海马CA1、CA3区PSD95的表达显著减少,D-gal+AAV-circ-Vps41组海马CA1、CA3区PSD95的表达显著降低;与D-gal+AAV-circ RNA NC组相比,D-gal+AAV-circ-Vps41组海马CA1区PSD95的表达显著增多,CA3区PSD95的表达无显著变化。结论:1.HT22衰老模型细胞内circ-Vps41表达显著下降,并且过表达circ-Vps41,可增加HT22衰老模型细胞内突触可塑性相关蛋白Syp、PSD95的表达。2.D-gal衰老模型小鼠出现学习记忆障碍,海马circ-Vps41的表达显著下降。3.过表达circ-Vps41可改善D-gal衰老模型小鼠的学习记忆障碍。4.过表达circ-Vps41可增加D-gal衰老模型小鼠海马树突棘密度以及突触可塑性相关蛋白Syp、PSD95的表达。