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背景:肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,根据国家癌症中心发布的恶性肿瘤数据显示,肝癌新发病例位居恶性肿瘤第四位,而死亡病例位居恶性肿瘤第二位。浸润和转移是区别良恶性肿瘤的两大根本特性。肝癌转移除经门静脉分支直接扩散和种植转移外,经淋巴道的肝外转移途径主要有肝门淋巴结、上腹部淋巴结和腹膜后淋巴结。且淋巴道转移范围是决定患者预后最重要的因素。Hca-P和Hca-F是我们实验组通过有限稀释法从同一小鼠肿瘤细胞中筛选出的一对具有不同淋巴道转移能力的细胞株。ALDH(aldehyde dehydrogenase gene,乙醛脱氢酶)是一种四聚体蛋白多态性酶,负责将乙醛氧化为乙酸。体内有多种基因编码的ALDH,其中线粒体乙醛脱氢酶(ALDH2)广泛表达于各种组织,但在肝脏中含量最高。文献报道,ALDH2的差异性表达可以引起一系列疾病,比如心血管疾病,糖尿病和肿瘤等。它在肝脏内主要负责酒精的降解,也是脂肪细胞分化的正调控因子。ALDH2作为ALDH家族中的一员,近几年它在多种肿瘤中被广泛研究。有研究发现ALDH2在肝癌、肾透明细胞癌、肺癌等肿瘤组织中的表达低于其相对应的癌旁组织,而在脑膜瘤组织中的表达上调;并且ALDH2基因多态性与胃癌、食管癌、胰腺癌、鼻咽癌等肿瘤的发生相关。组内前期采用定量蛋白质组学及基因芯片等技术筛选出ALDH2在Hca-P和Hca-F中有差异性表达,发现在163个差异蛋白点中,ALDH2在Hca-P细胞的表达是Hca-F细胞中的2.12倍。Daidzin,是一种从葛根中提取的异黄酮类物质,能竞争性结合ALDH2的催化位点,有效抑制ALDH2酶的生物学活性,是ALDH2的高效竞争性抑制剂。ANXA7(Annexin A7,膜联蛋白A7)是一种Ca2+磷脂集合蛋白,具有Ca 2+依赖膜融合活性,可促进膜聚集、融合、粘着、转运等,还可激活GTP酶,介导Ca 2+/GTP信号转导通路。组内前期研究表明,膜联蛋白A7在Hca-F中的表达高于Hca-P(约为3.0倍),可能是决定小鼠肝癌淋巴道转移的关键潜能基因之一。目的:本研究通过Western-blot、q PCR、ELISA、TRANSWELL以及免疫共沉淀、免疫荧光共定位等方法,观察并阐明ALDH2在肝癌细胞中的表达调控及其对肿瘤迁徙、侵袭的影响,探讨ANXA7和ALDH2的互相作用,进而研究ANXA7和ALDH2对不同淋巴道转移潜能肝癌细胞的影响,为肝癌进一步研究提供新的靶点。方法:1.复苏细胞Hca-P以及Hca-F并进行培养;2.Western-blot、q PCR检测Hca-P及Hca-F中ALDH2的表达;3.ELISA法选择ALDH2抑制剂Daidzin最佳工作浓度,并且用Western-blot、q PCR方法检测加入不同浓度抑制剂之后ALDH2的表达;4.构建Hca-P细胞ALDH2沉默转染细胞株,并且用q PCR、Western-blot方法检测Hca-P、ALDH2沉默Hca-P细胞、无关序列Hca-P细胞中ALDH2和ANXA7在m RNA、蛋白质水平的表达;5.构建Hca-P细胞ANXA7过表达基因转染细胞株,并且用q PCR、Western-blot方法检测Hca-P、ANXA7过表达Hca-P细胞、无关序列Hca-P细胞中ANXA7和ALDH2在m RNA、蛋白质水平的表达;6.TRANSWELL检测ALDH2基因调控对Hca-P的迁移和侵袭行为的影响;7.免疫共沉淀、免疫荧光共定位验证Hca-P、Hca-F中ALDH2和ANXA7为相互作用蛋白。结果:1.ALDH2在Hca-P、Hca-F中的差异性表达结果:Western-blot、q PCR结果均显示,ALDH2在Hca-P中的表达均高于Hca-F:在Hca-P中,ALDH2蛋白表达是Hca-F细胞中的2.5倍;而ALDH2 m RNA表达是Hca-F中的1.8倍;2.ALDH2抑制剂Daidzin最佳工作浓度为60umol/L,且在加入不同浓度抑制剂之后,Western-blot、q PCR结果显示,ALDH2在蛋白质、m RNA水平的表达量均无差异;3.ANXA7与ALDH2相互作用结果:q PCR、Western-blot结果显示,对比Hca-P、PNC组,ALDH2沉默组ANXA7表达显著升高;而对比Hca-P、PNC组,ANXA7过表达组ALDH2的表达显著降低。4.TRANSWELL结果显示:再加入抑制剂之后,Hca-P细胞的侵袭和迁移能力均增强:Hca-P细胞的侵袭能力是未加抑制剂细胞的1.7倍;迁移能力是未加抑制剂细胞的1.4倍;5.免疫共沉淀结果显示:在Hca-P细胞中,ANXA7和ALDH2共沉淀,而在对照组(Ig G组)中未见共沉淀;免疫荧光共定位结果显示:ANXA7与ALDH2两种蛋白主要在Hca-P/F细胞的细胞膜上共定位。结论:ALDH2在具有高淋巴道转移潜能的细胞Hca-P中的表达高于具有低淋巴道转移潜能的细胞Hca-F;抑制剂Daidzin对ALDH2并非通过改变其表达量来作用,而是通过抑制其酶活性来起到抑制作用;ALDH2具有抑制肝癌细胞Hca-P/F侵袭和迁移能力的潜能;ANXA7与ALDH2在肝癌的发生发展中可能相互影响相互作用。