结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,化疗在其治疗手段中占有重要地位。肿瘤细胞对化疗药物的耐受严重影响了化疗效果,其中凋亡通路的障碍是导致肿瘤细胞对化疗药物耐受的重要原因之一。Bcl-2家族蛋白是介导化学药物等细胞毒性信号刺激引起内源性凋亡途径的重要蛋白。当细胞受到这些信号刺激时,细胞是否凋亡很大程度上取决于Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白力量的平衡。BNIP3 (Bcl-2 /adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3)是Bcl-2家族中重要的促凋亡成员,它通过与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等形成异二聚体而拮抗其功能,或直接作用于线粒体外膜导致线粒体功能障碍,从而引起细胞凋亡(apoptosis)。此外,BNIP3还可以诱导细胞发生坏死样(necrosis-like)死亡和自噬性(autophagy)死亡。BNIP3在结直肠癌、胰腺癌和部分血液系统恶性肿瘤中表达降低或缺失,而且BNIP3的表达降低或缺失与胰腺癌对化疗抵抗有关。这提示,BNIP3的失活可能是导致恶性肿瘤细胞凋亡信号通路受阻、逃逸化疗药物诱导的细胞凋亡,从而对化疗药物产生耐受的重要因素之一。但是,BNIP3的表达对结直肠癌化疗敏感性的确切影响尚不清楚。BNIP3的表达沉默受基因启动子异常甲基化调控。DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成,具有催化甲基化功能的主要的DNMT有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b。BNIP3表达沉默的肿瘤细胞用DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-deoxycytidine, 5-aza-dC)处理,可恢复BNIP3的表达。因此,有望通过采用去甲基化手段,恢复BNIP3表达,促进细胞凋亡,增加结直肠癌等BNIP3表达沉默的肿瘤对化疗药物的敏感性。但是DNA甲基转移酶抑制剂由于在DNA合成过程中掺入DNA,可能导致DNA损伤而存在广泛的细胞毒性,以及治疗的非特异性而限制了其应用。RNA干扰是近年发展起来的使靶基因沉默的一种技术,它主要通过降解靶基因mRNA来实现敲除或失活相应基因的目的,具有良好的特异性及干扰效果,在临床靶向治疗中有着良好的应用前景。既往研究证实,应用RNA干扰手段单独抑制DNMT1表达或联合沉默DNMT1和DNMT3b的表达可以使肿瘤细胞高甲基化的抑癌基因启动子将不同程度地去甲基化,受甲基化控制的抑癌基因将得到不同程度的表达。但是干扰DNMTs对BNIP3基因的去甲基化作用以及对结肠癌化疗敏感性的影响目前尚不清楚。本文拟通过检测结直肠癌组织标本BNIP3的表达并分析其与临床化疗疗效的相关性,通过干扰结肠癌细胞株BNIP3表达,观察结肠癌细胞增殖、药物诱导的细胞凋亡和化疗敏感性的变化,以进一步探讨BNIP3对结直肠癌化疗的确切影响;拟通过检测结肠癌细胞株BNIP3基因启动子甲基化状态证实基因启动子异常甲基化是导致BNIP3沉默的重要机机制,应用RNAi技术干扰DNMT1和DNMT3b的表达,检测BNIP3的表达和甲基化状态的改变,以及结肠癌细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的变化,以进一步探讨RNA干扰DNMT1和DNMT3b的表达能否通过去甲基化作用恢复BNIP3的表达,增加结肠癌细胞的化疗敏感性。方法1、应用免疫组织化学方法检测81例应用“奥沙利铂联合5-Fu/CF”方案化疗的晚期结直肠癌患者肿瘤组织和远残端正常结直肠组织标本BNIP3的表达。用独立样本t检验比较BNIP3在肿瘤组织样本和正常组织样本的表达差异,用Spearman检验分析肿瘤组织样本BN1P3与HIF-1α表达的关系。肿瘤组织样本BNIP3的表达与临床参数和FOLFOX方案化疗疗效的相关性用χ2检验比较。用Kaplan-Meier法计算中位PFS和OS,描绘生存曲线,log-rank检验比较BNIP3阳性表达和阴性表达患者的PFS和OS。2、采用RT-PCR和Western印迹法检测八种人结肠癌细胞株BNIP3基因mRNA和蛋白表达。用甲基化特异PCR(methylation-specific PCR ,MSP)检测结肠癌细胞株BNIP3启动子甲基化状态,明确BNIP3的表达缺失与启动子甲基化的相关性。3、构建靶向BNIP3基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体(pGCsi3.0-BNIP3),转染结肠癌LoVo细胞,筛选稳定表达克隆。采用RT-PCR和Western blotting方法鉴定BNIP3的干扰效率。用MTT法、血球记数法、流式细胞仪分别检测干扰BNIP3表达对结肠癌LoVo细胞化疗敏感性、细胞增殖以及5-Fu诱导细胞细胞凋亡的影响。4、采用RT-PCR和Western印迹法检测DNMT1和DNMT3b在八种人结肠癌细胞株的表达。5、选择DNMT1和DNMT3b高表达而BNIP3表达沉默的结肠癌HT-29细胞作为细胞模型,单独或联合转染化学合成DNMT1 siRNA和DNMT3b siRNA,并用DNMT抑制剂5-aza-dC作为阳性对照。采用Western blotting方法鉴定DNMT1和DNMT3b的干扰效率。用RT-PCR和Western blotting方法检测BNIP3的表达变化,MSP检测BNIP3启动子DNA甲基化状态的改变。采用MTT法、克隆形成实验、流式细胞仪分别检测干扰DNMTs表达对结肠癌HT-29细胞化疗敏感性、克隆形成能力以及细胞周期和凋亡的影响。结果1、结直肠肿瘤组织中的BNIP3免疫积分显著低于正常结直肠组织(1.8±0.2 v 3.7±0.5, P<0.05)。肿瘤组织BNIP3的表达与HIF-1α表达无相关性。BNIP3表达阳性病例对化疗的客观反应率显著高于BNIP3表达阴性病例(53.8% v 28.6%; P=0.021),而且BNIP3阳性病例的中位无进展生存期(PFS)显著长于BNIP3阴性病例(9.25 v 6.5 months, P=0.011)。BNIP3阳性患者的中位总生存期(OS)较BNIP3阴性病例延长(17.25 v 15.0 months),但是统计分析无显著差异(P=0.143)。2、在人结肠癌八种细胞株中HCT-116、LS174T和LoVo三种细胞有明显BNIP3表达,低氧处理24h后BNIP3的表达较常氧培养条件下明显增强。BNIP3在SW620细胞仅有微弱表达。其余四种细胞在mRNA水平和蛋白水平均不能见到表达条带,即使低氧处理24h也无明显变化。MSP检测BNIP3启动子DNA甲基化状态结果显示,BNIP3表达降低或沉默的五种细胞均能够扩增得到甲基化产物。3、RNAi技术可特异性沉默LoVo细胞BNIP3基因表达,mRNA和蛋白水平表达抑制率分别为73.1%和75.4%。4、抑制BNIP3基因表达使LoVo细胞体外生长增殖速度明显加快。与对照组LoVo细胞相比,BNIP3 RNAi的LoVo细胞5-FU诱导的细胞凋亡率显著减少(8.35±0.46 v 19.75±2.37, P<0.05), 5-FU作用的IC50值显著增高(108.4±4.69μg/ml v 50.08±2.85μg/ml , P<0.05)。5、DNMT1在八种人结肠癌细胞株中均高表达,DNMT3b差异性明显表达。6、应用siRNA可特异性沉默HT-29细胞DNMT1和DNMT3b基因表达,蛋白水平表达抑制率分别为76.0%和71.1%。7、单独应用DNMT1siRNA和联合应用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA使BNIP3基因启动子去甲基化,诱导BNIP3的表达。联合应用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA较单独应用DNMT1siRNA的作用更显著,联合应用与1uM5-aza-dC作用相当。而单独应用DNMT3BsiRNA和阴性对照组HT-29细胞BNIP3基因启动子甲基化状态和BNIP3的表达无明显影响。8、单独应用DNMT1siRNA和联合应用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA使HT-29细胞体外克隆形成能力明显下降,细胞克隆形成率分别为(15.4±3.7)%和(2.1±0.43)%,与阴性对照组(25.8±5.1)%比较有显著差异。与阴性对照组HT-29细胞相比,单独应用DNMT1siRNA和联合应用DNMT1siRNA、DNMT3b siRNA的HT-29细胞其G0/G1期细胞数分别增加21.72% and 28.33%, S期的细胞数分别减少30.86% and 44.56%,细胞凋亡率分别增加6.1 and 13.34倍(P<0.05)。与阴性对照组HT-29细胞IC50值比较,单独应用DNMT1siRNA和联合应用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA的HT-29细胞5-FU的IC50值均显著降低(171.5±15.20μg/ml v 376.5±33.69μg/ml,45.54±12.88μg/ml v 376.5±33.69μg/ml,P均<0.05)。联合应用DNMT1siRNA、DNMT3b siRNA组的HT-29细胞克隆形成能力、细胞凋亡率和5-FU的IC50值的改变较单独转染DNMT1 siRNA组均更显著(P均<0.05)。单独应用DNMT3b siRNA和阴性对照对HT-29细胞克隆形成能力、细胞凋亡率和5-FU的IC50值均无显著改变。结论1.BNIP3在结肠癌组织和细胞中表达降低或沉默,基因启动子异常甲基化是BNIP3表达下调的重要原因。2.BNIP3表达与晚期结直肠癌患者FOLFOX方案化疗疗效相关。阻断结肠癌细胞BNIP3基因表达,可通过促进细胞增殖,减少5-Fu药物诱导的细胞凋亡,来降低结肠癌细胞对5-FU的敏感性。这提示BNIP3可能是结直肠癌治疗的潜在靶点。3.RNAi技术可特异性抑制DNMT1和DNMT3b基因表达。双重干扰DNMT1、DNMT3b表达或单独干扰DNMT1表达可通过基因启动子去甲基化作用诱导HT-29细胞BNIP3表达,同时还可降低HT-29细胞的克隆形成能力、促进细胞凋亡,增加5-Fu的化疗敏感性。提示通过RNAi特异性阻断DNMT1和DNMT3b表达是治疗结肠癌的有效方法。4. DNMT1、DNMT3b双重干扰的效果显著优于单独干扰DNMT1。这提示DNMT1在结肠癌基因甲基化过程中起着主要作用,而DNMT3b则起着辅助作用,两者共同发挥协同作用。