论文部分内容阅读
钠氢离子交换蛋白(NHE)是广泛存在于细胞膜的跨膜蛋白,具有pHi调定点,决定胞内pHi水平,对细胞内外环境稳态,细胞行为调节的发生和发展以及组织损伤具有密切关系。NHE的9个同种型分别在不同的组织和细胞分布。NHE1是目前研究最为清楚的一个同种型,此外NHE1对组织损伤具有重要作用,尤其在心肌中。2006年鸡的NHE1(chNHE1)被证明是ALV-J受体。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)为RNA病毒,能够引起组织损伤,生长抑制,生产性能下降及肿瘤,但由于自身的超突变性以及引起疾病的复杂性,至今未研究清楚其感染机制和有效的疫苗或者药物,严重危害了我国养禽业。ALV-J的感染过程,首先由Env与受体ch NHE1相互作用,进而引起组织损伤和生产性能下降等各种症状。chNHE1与Env直接结合,随后Env跨膜区(TM)构象发生改变来促进病毒与细胞的融合,该步骤是病毒进入细胞的关键环节。ch NHE1第一膜外环(ECL1)是最大膜外环,因此阻断ECL1受体可能阻断ALV-J的感染,从而减轻机体的组织损伤程度。那么chNHE1对ALV-J诱导的组织损伤是否具有决定性作用?这一问题值得深入探究。本研究拟通过制备chNHE1第一膜外环抗体,检测其阻断ALV-J感染的效果及组织的保护作用效果,从而明确chNHE1在ALV-J诱导组织损伤中的决定性作用。我们首先从SPF鸡的肾脏中获得ECL1基因并制备Anti-ECL1抗体,设置4个组:A(Normal组)、B(Anti-ECL1组)、C(ALV-J组)、D(ALV-J+Anti-ECL1组);将Anti-ECL1抗体经细胞毒性检测,确保对细胞无损伤情况下,将Anti-ECL1抗体和ALV-J同时作用于细胞,分别通过荧光定量PCR方法和ELISA方法检测Anti-ECL1抗体阻断ALV-J感染的效果,检测结果表明在48h内,D组(ALV-J+Anti-ECL1)ALV-J NX0101 RNA拷贝数显著低于C组(ALV-J),随时间的延长,D组(ALV-J+Anti-ECL1)ALV-J NX0101RNA拷贝数与C组(ALV-J)无差异;ELISA检测ALV-J抗原p27表达水平在72h内显著低于C组,证明Anti-ECL1抗体在限定的时间内可有效阻断ALV-J感染DF-1细胞。拟通过给ALV-J感染鸡注射Anti-ECL1抗体,检测Anti-ECL1抗体对ALV-J感染鸡组织器官的保护效果,相对定量PCR和免疫组织化学结果表明,D组(ALV-J+Anti-ECL1)ALV-J NX0101拷贝数与C组(ALV-J)相比显著降低,且D组(ALV-J+Anti-ECL1)ALV-J抗原表达水平降低;在肝脏中D组(ALV-J+Anti-ECL1)ALV-JNX0101拷贝数显著降低,但ALV-J抗原表达水平无明显变化,结果表明Anti-ECL1抗体对感染ALV-J鸡的心脏和肝脏具有保护作用,但对其他组织器官保护作用不显著,据此我们推测Anti-ECL1抗体对组织器官的保护能力与ALV-J对组织器官的靶向性相关。为验证chNHE1在ALV-J感染鸡免疫器官的表达,用免疫组织化学方法检测ALV-J感染鸡的骨髓,胸腺,脾脏和法氏囊等免疫器官中chNHE1均有上调,chNHE1在骨髓的髓系细胞系表现明显。目前人类医学领域研究表明,NHE1对心肌缺血/再灌注,心肌损伤或心脏衰竭具有重要作用,诸多相关学者研究抑制NHE1制剂或者化学药物从而减轻心肌损伤程度,保证人身安全,本研究也为此工作提供部分参考。再者ECL1是ALV-J受体的关键域,但是ALV-J受体是否还具有辅助受体或者其他辅助因子仍是在研究中。综上所述,本研究表明Anti-ECL1抗体可在限定时间内有效阻断ALV-J的感染;Anti-ECL1对心肌和肝脏具有显著的保护作用,但ECL1域不是ALV-J感染细胞的唯一结合部位;感染ALV-J鸡chNHE1在免疫组织器官表达均有上调,在骨髓髓系细胞表现明显;chNHE1在ALV-J诱导的组织损伤中起决定作用;此发现为人类医学心肌损伤的所引起的各种疾病奠定一部分参考;亦为ALV-J及相关病毒的控制提供了新的思路与方法。