蜂毒肽,作为蜂毒的主要成分,是一种具有α螺旋结构的两亲性多肽。蜂毒肽在疾病治疗上有广泛的应用,具有抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗辐射和降血压等作用。蜂毒肽应用于肿瘤治疗具有独特优势,能够在质膜上打孔造成细胞裂解死亡,从而避开了肿瘤的耐药性问题。然而,蜂毒肽自身存在的溶血性问题、非特异性作用以及易被代谢降解等缺点,严重阻碍了其在抗肿瘤方面的临床应用。如何在活体内安全有效地运输蜂毒肽抵达肿瘤组织而不产生毒副作用,仍是极具挑战的难题。本文采用以仿HDL多肽脂质纳米颗粒为基础的运载方法,有效地解决了蜂毒肽在活体肿瘤治疗中存在的溶血问题,并延长了其在体内的循环周期,而且实现了在肿瘤区域特异性地释放,主要取得了以下研究结果：(1)发明了一种新型的含蜂毒肽的功能性杂化多肽α-melittin。它是由蜂毒肽与一条α螺旋结构的载脂蛋白模拟肽(α-peptide)通过共价连接而成。α-melittin在保留了蜂毒肽的自发形成多聚体和裂解细胞等属性的基础上,具有更强的磷脂亲和力以及α螺旋结构形成能力。与α-peptide相比,α-melittin具有更强大的粒径控制力,能够将磷脂形成的纳米颗粒粒径控制在10nm左右甚至更小,同时具有很高的包封率(>80%)。(2)利用α-melittin合成的脂质纳米颗粒α-melittin-NP,实现了活体内蜂毒肽的安全有效递送。α-melittin-NPs是一种粒径在14nm左右,分散性良好的球形纳米颗粒,其核心可以同时运载疏水性分子。α-melittin-NPs性质稳定,在血清和血浆等生理溶液中仍然保持稳定的纳米结构。凭借蜂毒肽与α-peptide羧基端疏水性氨基酸的连接设计以及α-melittin与磷脂层的强力结合,α-melittin-NPs有效地隐藏了蜂毒肽的阳离子电荷(21.33±1.64mV),表现为近中性纳米颗粒(2.45±0.56mV)。α-melittin-NPs明显降低了蜂毒肽的溶血性和非特异性破坏作用。体外溶血实验表明,α-melittin-NPs对血细胞的裂解作用显著降低,即使在501μM的高浓度下也只有8%左右的溶血率。细胞增殖实验显示,α-melittin-NPs对细胞生长抑制的IC50值(11.26±1.37μM)较蜂毒肽(1.71±0.04μM)有显著的提升。激光共聚焦连续成像的结果表明,α-melittin-NPs与黑色素瘤细胞接触后造成细胞膜通透性改变,诱导细胞内容物泄漏、细胞核分解,最终导致细胞死亡。Annexin V-FITC/PI的双色标记和流式分析结果表明,α-melittin-NPs导致肿瘤细胞死亡的主要途径是发生坏死,也能诱导少量细胞发生凋亡。最后,α-melittin-NPs通过尾静脉注射至皮下荷瘤鼠体内。经过4次给药治疗,黑色素瘤的生长得到了明显抑制,与对照组相比其抑制率高达82.8%。与此同时,通过对治疗小鼠血液的生理生化指标的检测,以及对脏器的病理切片分析,并未显示α-melittin-NPs对机体产生明显的毒副作用。(3)研制同步运输紫杉醇和蜂毒肽的超小纳米颗粒(PTX-OL)α-melittin-NPs,具有协同抗黑色素瘤的作用。利用激光共聚焦显微镜观察到α-melittin-NPs在与肿瘤细胞相互作用时,会将蜂毒肽释放至包括质膜在内的膜系统上,而核心内的染料分子则被直接释放至胞浆中。(PTX-OL)α-melittin-NPs在两个治疗机制上充分发挥了紫杉醇和蜂毒肽的抗肿瘤功能。肿瘤细胞增殖实验的结果显示,(PTX-OL)α-melittin-NPs对黑色素瘤杀伤效率明显增强,IC50值是α-melittin-NPs的44.8%。Annexin V-FITC/PI双色标记和流式分析结果表明,相比于α-melittin-NPs,(PTX-OL)α-melittin-NPs能够诱导更多细胞发生坏死,提升幅度为10-20%。而且,在活体黑色素瘤治疗上,(PTX-OL)α-melittin-NPs同样展现出增强的肿瘤生长抑制效果。综上所述,本研究利用仿HDL多肽脂质纳米颗粒作为蜂毒肽的运载体,通过将蜂毒肽隐藏在单层磷脂分子层内,有效地解决了其在体内运输中存在的溶血性和非特异性作用的问题,提高了蜂毒肽在体内的循环半衰期,为在活体内使用蜂毒肽治疗肿瘤提供了有效的工具。采用蜂毒肽与化疗药物协同配合的方法,将会突破单一靶标在肿瘤治疗上的限制,为肿瘤的多靶点治疗带来了新的机遇。