超分辨显微中的样本漂移测定与修正

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宽场光学显微镜在很多领域都已得到广泛的应用,特别是生命科学领域。然而,由于光学衍射极限的限制,传统宽场显微镜只能探测到物体在波长尺度大小的细节。超分辨纳米光学显微镜,例如受激发射损耗显微镜,随机光学重建显微镜,荧光光敏定位显微镜,都是运用标记物(荧光染料、荧光蛋白、量子点等)的光物理性质来提高成像的空间分辨率。具体来说,通过控制标记物发射荧光信号的开启和关闭状态,超分辨纳米光学显微镜可以突破衍射极限的限制,揭示出小于衍射极限尺度内的信息,从而得到更高的空间分辨率。对于基于单分子定位的超分辨技术,由于标记物彼此之间的距离远小于光学衍射极限分辨率,所以通过控制这些标记物在不同时间点发射荧光信号,就可以将它们在空间上精确地区分开。这些成像方式均是用时间分辨率换取高空间分辨率,因此基于单分子定位的超分辨纳米光学显微镜相对于传统受衍射极限限制的宽场光学显微镜需要更长的成像时间,以获得更精细的样品结构。这使得这类超分辨纳米光学显微镜对光学系统和仪器的不稳定性更为敏感,即使样本相对物镜出现很小的移动,也会对图像的定量分析产生较大的影响。因此,在超分辨显微成像技术中准确的测量样本漂移并修正漂移的影响对超分辨显微成像来说意义重大。  本文详细介绍了先前解决漂移问题的各种算法,将这些算法分为需要引入基准标记物与不需要引入基准标记物两大类。需要引入基准标记物----主动三维矫正漂移方法,这个方法用背射式聚集系统测量放入显微镜载玻片内的基准标记物位置,然后由压电控制平台修正漂移。由于此方法需要引入基准标记物,制备基准标记物需要繁琐的步骤,而且实验需要添加额外的仪器,因此不是解决漂移问题最好的方法。不需要引入基准标记物的方法,已发表的有使用互相关法计算两幅图之间漂移的大小,为了降低噪声的影响,再用二维高斯拟合判断互相关图像最大值的位置,以判断漂移量大小,达到矫正的目的。但是,当荧光样本过于稠密,以至于投影样本结构无法显示时,这种算法无法实现准确地对漂移进行校正。此外,经过超高分辨率显微系统成像后,荧光样本不可避免地会被光漂白。用初始时刻图像与部分被光漂白的荧光图像做互相关,会影响计算漂移量的精确度,带来系统误差。如果当图像很大,或者处理图像张数过多时,算法计算量过大的缺点也是无法回避的。  本文采用的方法是,选取图像中最亮的区域,并将此位置作为标记图像的位置。由于最亮区域会随图像的漂移而同时漂移,就可以通过定位最亮区域的位置来定位图像的位置。定位移动目标物已有五种算法,分别为:质心法,维高斯拟合法,互相关法,求和绝对值差分法,改进后的质心法。将这些算法在不同信噪比下做比较,得出用改进后的质心法对移动目标物定位,得到的位置与实际移动位置的偏差和此偏差的标准差最小。超分辨显微成像系统在对样本采样时,如果样本被部分光漂白,最亮区域光强在空间的分布还是中间区域占较大权重。本文引用测量图像的信噪比计算方法对超分辨显微荧光图像进行计算,然后得出不同信噪比下的定位偏差与标准差。拟合荧光小球和细胞微丝,并添加一定强度的泊松噪声和高斯噪声,得出用改进后的质心法定位结果与真实位移量基本吻合。最后,本文采用这种方法对不同时刻图像进行定位,并且矫正漂移的影响。
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