白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)是一种主要由Th2细胞、巨噬细胞和活化的B细胞分泌产生的细胞因子，在免疫调节、造血及炎症过程中起重要的作用。研究发现IL-10在自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病等发病中起一定调节作用外，在器官移植的排斥反应和免疫耐受中也起着相当重要的调节作用。在哮喘疾病的研究中，人们对炎性因子例如IL-2、IL-4、IL-5研究较多，而对具有抑制炎症作用的细胞因子例如IL-10研究较少。最近研究发现，IL-10通过抑制多种细胞因子的合成，对哮喘的治疗、转归具有重要意义。 目的：本文利用现代分子生物学实验方法，构建mIL-10重组腺病毒载体，制备具有活性的重组腺病毒，并对表达的mIL-10的活性进行分析检测。为研究IL-10分子生物学及药理学活性奠定了良好的基础，并为细胞因子补充和添加疗法治疗哮喘和基因治疗哮喘等临床研究做好了前期准备。 方法：从刺激后的小鼠脾细胞中克隆出mIL-10片段，利用pShuttle载体将mIL-10片段连入腺病毒载体，并用PCR反应和酶切反应对构建的重组腺病毒载体进行鉴定。分别从磷酸钙转染的pH值、DNA纯度、转染后培养时间和甘油休克时间等方面优化转染条件，根据最优条件，将mIL-10重组腺病毒载体转染入HEK 293T细胞，制备mIL-10重组腺病毒。分别用PCR反应验证病毒的制备和终点稀释检测法测定病毒的滴度。对mIL-10的表达量和活性，采用ELISA法进行定量和检测。 结果：(1)经测序证实从小鼠脾细胞中克隆的mIL-10 cDNA序列与基因库报告的序列完全一致；mIL-10片段连入腺病毒载体后经过腺病毒载体上特异引物进行PCR反应，可见312bp目的带，证实腺病毒载体构建成功；同时用Xho Ⅰ单酶切后，可见在没有重组的腺病毒载体中出现的特异条带，在阳性的重组腺病毒载体中消失，用P工一交el/工一ceu工双酶切后，可见重组腺病毒载体被双酶切为约1.skb和大于23kb的条带，单酶切和双酶切鉴定均为阳性，证实腺病毒载体构建成功; (2)经过优化磷酸钙转染法的条件，确定pH值在6.96时和纯化的质粒转染效果最好，细胞存活率高;转染后培养6h进行甘油休克效果最佳，比培养Oh直接进行休克转染效率升高584.4%;甘油休克时间为4.5 min时转染效果最佳，比不用甘油休克转染效率升高130.8%，对于HEK 293T细胞磷酸钙转染效率为8.9x 10一3一2.0x10一，; (3)病毒扩增后，有明显的CPE现象，经过腺病毒载体上特异引物进行PCR反应，可见312bP目的带，证明病毒扩增成功;终点稀释检测法测定病毒滴度为2 .5 x 1 O7pfu/ml;(4)活性分析表明，重组腺病毒在HEK 293T细胞中产生活性mIL一10。 结论:本文成功构建了mIL一10重组腺病毒载体，并通过对磷酸钙转染条件的优化，高效地将重组腺病毒载体转入HEK 293T细胞，并且成功表达了mIL一10细胞因子，得到了具有活性的mIL一10重组腺病毒，为下一步对哮喘等疾病的基因治疗奠定了坚实的基础。