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类脂A，俗称内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞外膜外侧的重要组成成分，在维持细胞外膜完整性通透性以及免疫系统识别等方面起着重要作用当细菌侵入宿主后，其表层类脂A可以被宿主免疫细胞表面的TLR4受体识别，随之引发胞内的信号通路，生产及释放IL-8和TNF-α等与防御相关的细胞因子TLR4对类脂A的识别能力主要取决于类脂A的结构，因此细菌的感染能力和致病毒力与其类脂A的精细结构密切相关弗朗西斯菌（Francisella tularensis）为细胞内寄生的革兰氏阴性细菌，一旦侵入宿主，可以引发重度肺部感染性人畜共患病土拉热研究表明，弗朗西斯菌的类脂A结构不能被宿主免疫系统的TLR4识别，与其致病毒力密切相关，但相关的分子机制有待阐明为了更好的研究弗朗西斯菌类脂A结构与致病毒力之间的关系，本研究通过多种质谱分析方法，鉴定了弗朗西斯菌类脂A的结构多样性；同时利用生物信息学分析方法全基因组芯片基因高效表达蛋白纯化和酶学性质分析基因敲除突变株构建和细菌致病毒力研究等方法手段，发现了与类脂A结构多样性相关的基因，深入研究了相关的分子机制主要研究内容如下：（1）利用高分辨率多级质谱鉴定了弗朗西斯菌类脂A的结构多样性，发现了类脂A分子结构受温度变化影响的规律体外模拟弗朗西斯菌生存环境的温度变化，在三种不同温度（18oC,25oC和37oC）下培养弗朗西斯菌，提取类脂A，利用高分辨率质谱进行结构分析和鉴定MALDI-TOFMS一级质谱结果表明：弗朗西斯菌在不同温度下可以合成不同结构的类脂A（18oC–m/z1609,25oC-m/z1637,37oC-m/z1665）；随着温度的降低，弗朗西斯菌合成类脂A的脂肪酸链长度变短（C2H4-m/z24） QIT-TOF MSn多级质谱鉴定表明：类脂A的结构存在多样性，结构的变化主要发生在N-连接的2位和2’位脂肪酸的链长上ESI-Q-TOFLC-MS表明：在不同的温度下，类脂A合成的中间代谢产物（Lipid X）的结构也存在多样性温度变化动态模拟分析表明：一旦环境温度改变，弗朗西斯菌便可迅速调整类脂A分子的精细结构（2）鉴定了弗朗西斯菌类脂A合成途径中的关键基因lpxD1和lpxD2，探明了二者转录水平的差异与温度的相关性通过生物信息学分析，鉴定了弗朗西斯菌中存在的两个类脂A羟基脂肪酸转移酶编码基因lpxD1和lpxD2LpxD催化类脂A合成途径的第三步反应，在革兰氏阴性细菌内相对保守，一般只有一个，但在弗朗西斯菌体内却存在两个LpxD1和LpxD2之间氨基酸序列同源性为34%，各自在不同的弗朗西斯菌亚种中同源性高达98%进化树分析发现：LpxD1与大肠杆菌的LpxD同源性很高，而LpxD2却与很多厌氧菌的LpxD同源性高全基因组芯片的转录组学分析发现：lpxD1的转录在37oC上调，而lpxD2的转录在21oC上调在大肠杆菌中异源表达弗朗西斯菌的LpxD1或LpxD2，其类脂A的结构发生变化野生型大肠杆菌类脂A在2位和2’位含有短链脂肪酸3-OH-C14（m/z1796），而表达了LpxD1或LpxD2的大肠杆菌类脂A在2位和2’位上添加长链的脂肪酸3-OH-C16或3-OH-C18（m/z1824,1852） THP-1细胞实验表明：TLR4对经过LpxD1或LpxD2修饰调节后含有长链脂肪酸的类脂A的识别能力减弱（3）分离纯化了LpxD1和LpxD2酶蛋白，并进行了酶学性质分析，发现了二者最适催化温度的差异首先，在大肠杆菌中构建了LpxD1或LpxD2的高效表达菌株，并分离纯化了两种蛋白LpxD1和LpxD2；其次，合成制备并纯化了LpxD反应必需的两个底物Acyl-ACP和UDP32-Acyl-GlcN；最后对LpxD1和LpxD2的酶学性质进行了分析研究研究结果表明：LpxD1在37oC的酶活是在21oC的2.1倍，而LpxD2在21oC的酶活是在37oC的17.5倍，说明两个蛋白的活性受温度调控；底物特异性实验结果表明：LpxD1的最适底物为3-OH-C18，而LpxD2的最适底物为3-OH-C16；LpxD1和LpxD2的最适pH均在7.5左右；高浓度钙离子（100mM）对两个蛋白的活性有抑制作用（4）构建了弗朗西斯菌脂肪酸酰基转移酶突变株ΔlpxD1和ΔlpxD2，并分析了突变株类脂A结构的变化通过基因同源重组方法构建了弗朗西斯菌ΔlpxD1和ΔlpxD2突变株提取突变株在不同温度下合成的类脂A，并用质谱进行结构鉴定分析结果表明：两个突变株在不同温度下合成的类脂A不再受温度的影响，ΔlpxD1突变株合成的类脂A的结构锁定在m/z1609，而ΔlpxD2突变株合成的类脂A的结构锁定在m/z1665利用多级质谱对类脂A结构多样性分析发现：两个突变株的类脂A结构多样性明显降低；ΔlpxD1突变株合成的类脂A在2位和2’位上含有3-OH-C16，而ΔlpxD2突变株合成的类脂A在2位和2’位上含有3-OH-C18ΔlpxD1和ΔlpxD2突变株的回补体的表型与野生型相似，合成的类脂A分子存在结构多样性并且受到温度调控ΔlpxD1和ΔlpxD2突变株在不同环境下的生长速率有区别：在培养基中，ΔlpxD1突变株的生长速率较ΔlpxD2突变株和野生型有所降低，但是到了对数生长期，三者速率基本一致；在巨噬细胞内生长时，ΔlpxD1突变株生长速率比野生型和ΔlpxD2突变株明显降低（5）通过研究ΔlpxD1和ΔlpxD2突变株对细胞膜通透性及致病毒力的影响，发现ΔlpxD1突变株不仅丧失致病能力，并且对小鼠有免疫保护作用细胞外膜渗透性实验表明：与野生型和ΔlpxD2突变株相比，ΔlpxD1突变株的细胞通透性增强，对抗生素和阳离子抗菌肽的敏感性增强小鼠感染实验表明：野生型和ΔlpxD2突变株感染的小鼠均在三天后死亡，而ΔlpxD1突变株感染的小鼠可以存活，表明ΔlpxD1突变株的致病能力丧失；一个月前注射ΔlpxD1突变株可以对小鼠产生免疫保护能力，加强免疫策略可以进一步提高对小鼠的免疫保护能力综上所述，本论文研究发现了与弗朗西斯菌类脂A结构合成相关的两个关键基因-lpxD1和lpxD2这两个基因的转录受温度调控，同时这两个基因编码的酶的活性也受温度调控这两个层次上的温度调控是导致弗朗西斯菌类脂A的结构多样性的重要因素类脂A的分子结构随生长温度不同而发生链长的变化，导致细胞膜的通透性改变，增强了弗朗西斯菌在不同环境温度下的生存能力本论文研究揭示了温度是造成弗朗西斯菌类脂A分子结构多样性的一个主要原因，LpxD1和LpxD2对从转录和蛋白水平上调控类脂A结构多样性起到了关键的作用研究结果对改善革兰氏阴性工业生产菌的细胞膜通透性和降低其内毒素分子的毒性对新型抗生素和疫苗及疫苗佐剂的开发均具有重要的指导作用