我们前期研究中,从具有广谱中和活性的HIV-1感染者(DRVI01)分离获得了一株针对CD4结合位点的VRC01样广谱单克隆中和抗体DRVIA7(A7)。系统分析A7连续5年间的发展表明,抗体重链在两年内快速成熟,但抗体轻链发展受阻于gp120蛋白LoopD区及V5区的糖链,导致该谱系抗体有限的中和宽度。如果能找到与A7谱系早期抗体结合的膜蛋白(Env),或通过Env改造设计中和难度逐渐加大的免疫原,或许能诱导出A7样抗体甚至帮助抗体越过糖分子障碍。本课题将在前期对A7抗体研究的基础上,系统分析感染者五年间6个时间点的病毒膜蛋白及其中和表型特征。第一部分对DRVI01感染者的膜蛋白基因及其中和特征研究中,我们通过单拷贝基因组扩增(SGA)技术获得156条全长膜蛋白基因,筛选鉴定出68个功能性膜蛋白并制备了假病毒。序列分析和假病毒中和实验显示,DRVI0]体内膜蛋白序列多样性的逐渐增加与A7谱系抗体的出现和成熟一致;广谱高效中和活性及自体病毒逃避同期血浆中和的能力,与膜蛋白上抗体识别位点较多的氨基酸变异一致,提示病毒和抗体间连续的共进化现象。序列分析还发现了几个可能有利于CD4bs抗体识别的膜蛋白特征,如前期4个时间点的膜蛋白VIV2区较短、糖基化位点较少及糖基化模序NXT:NXS 比值较低,这些特征在中和抗体产生中的作用有待进一步研究。序列一致性分析揭示了病毒在5个时间点进化过程中氨基酸突变的热点区域,解析突变热点背后的影响因素,可为进一步寻找新的中和抗体提供线索。在第二部分DRVI01来源的膜蛋白对VRC01和A7重构抗体抵抗机制的研究中,我们筛选鉴定了影响VRC01敏感性的关键氨基酸位点。以往的研究认为位于膜蛋白V5区的N464位氨基酸与VRC01中和敏感性无关,但我们的研究发现,膜蛋白N464T单点突变可以将突变株由VRC0I敏感逆转为抵抗,而T464N单点突变将突变株由VRC01抵抗逆转为敏感。N460A、E279D、R282K突变导致DRVI01假病毒对VRC01的中和敏感性由突变前的抵抗转为敏感。根据突变株与A7谱系抗体中和结果,我们设计了 4个能与不同中和宽度的A7谱系抗体结合的免疫原,以期模拟体内A7谱系抗体产生及成熟的过程。在第二部分基于膜蛋白进化特征的潜在中和抗体分析的研究中,通过分析DRVI01的156条全长膜蛋白氨基酸序列,筛查bNAbs表位关键氨基酸的变异,结合将膜蛋白回复突变后与同期血浆进行自体中和实验观察突变前后毒株中和敏感性的变化,推测DRVI01感染者样本中除存在CD4bs类中和特异性外,可能还存在gp41融合肽类、gp120/gp41交界面类中和特异性,这为下一步的抗体分离实验提供了参考信息。