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目的:作为所有消化系统里恶性肿瘤之一的胰腺癌,它最重要的特点就是发病隐匿、初期诊断困难、并且发展非常的迅猛、临床预后效果极其的差。现在,应用吉西他滨等药物的治疗和采用手术治疗是近10几年来胰腺癌最主要的治疗方法,最近几年,胰腺癌的发病率明显呈上升趋势,每年新增加的病例就有大约20万人左右,而对于胰腺癌治疗方面近几年仍没有突破性的进展,无论是用于新辅助治疗还是辅助化疗治疗,供临床选择的方法都极其有限[1]。胰腺癌诊治的关键,如果要对胰腺癌的诊治产生积极的作用,那么首先就需要能够早期发现胰腺癌,并能精确的诊断,能够对胰腺癌或者疑似胰腺癌的患者进行相关分子标志物的风险评估,然后能够给予早期的、及时的干预予以防止恶化。现在虽然开腹手术切除胰腺癌的临床病理诊断是胰腺癌诊断的金标准,但是对于疑似、早期或无法切除肿瘤的胰腺癌患者,通过手术切除胰腺癌组织进而明确诊断、判断预后则存在困难[2,3]。超声内镜检查在评估胰腺占位性病变中具有高度的准确性,特别是对直径小于2cm的病灶非常敏感,甚至直径小于5mm的小病灶也可以发现,并且超声内镜引导下细针抽吸（Endoscopic ultrasonography guided fine-needle aspiration,EUS-FNA）)对于胰腺肿瘤的诊断和预测预后已经取得了显著的效果,其诊断灵敏度高,可以对穿刺获得的组织样本进行病理学（液基细胞或者组织学）检查,这在术前对肿瘤的良性和恶性的鉴别诊断是有意义的,并且对于术后及晚期患者预测预后是有价值的[4,5]。在《中国内镜超声引导下细针穿刺的临床应用指南》（2017年发表）一文中指出,经EUS-FNA抽取组织可做为胰腺肿瘤进行病理学方面诊断的首选方法之一。分子生物学技术对分子生物的敏感性很高,所以对于细胞学表现为非典型或着病理疑似恶性的肿瘤穿刺物,用分子生物学技术进行检测,可以使一些患者避免多次的穿刺检查,并且对于一些良性占位的病患可以避免手术带来的伤害,从而使术后并发症的发生率下降,能够达到初期诊断胰腺癌并改善其预后的效果,使其死亡率降低;同时可以对晚期患者抽吸组织针对性检测基因及相关分子变化,及时调整治疗方案[6,7]。EUS-FNA技术可以为胰腺癌的早期诊断和预测预后提供非常好的检测手段,是由于它可以直接获取胰腺组织细胞和组织间液样本,提高了诊断的灵敏度和特异性,因此需要发现一些新的、敏感的分子标志物,结合EUS-FNA技术帮助早期诊断胰腺癌。近几年来,一些相关研究报道环状RNA可能会为肿瘤诊断提供新的分子标志物,因此,本研究通过对胰腺癌及胰腺癌旁组织采用了全转录组高通量测序筛查circ RNA表达谱,通过互作网络的进一步分析,找出差异circRNA,差异性miRNA及差异性mRNA。收集胰腺癌组织和癌旁组织标本,通过扩大样本量,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）方法,对选取的差异circ RNA进行初步验证。根据表达验证结果,利用RT-qPCR、Western blot等方法验证选定hsacirc0006215、miR-378a-3p及SERPINA4的调控关系,为筛查新型的胰腺癌特异性诊断标志物提供一定的基础。研究方法:研究对象分两组,实验组:胰腺癌组织标本4例,分别标记为CA6、CA7、CA8、CA9;对照组:胰腺癌旁组织标本4例,分别标记为NT6、NT7、NT8、NT9。通过全转录组高通量测序筛查,筛查circRNA的表达谱,进一步分析互作网络,找出差异circ RNA,差异miRNA以及差异mRNAs。对circRNA进行功能解释分析、代谢通路分析等,初步间接了解circRNA功能。通过以下解析:差异倍数、统计学意义、相关编码基因功能、长度特征、样本原始密度值等策略,同时根据候选基因与胰腺癌生物学特点的符合率情况,筛选出circ RNA及circ RNA-miRNA-mRNA互作网络,并且筛选出的网络具有最高的特异性,拥有研究价值。扩大样本量,收集胰腺癌组织标本30例、胰腺癌旁组织标本30例。采用Trizol一步法分别提取胰腺癌及癌旁组织中总RNA并检测其OD值（吸光度A260/A280值）;将总RNA反转录成c DNA;根据选取候选circRNA序列设计并合成引物,选择合适内参序列,利用RT-q PCR方法进行扩增,对扩增产物进行相对定量分析及统计学分析;根据RT-qPCR检测结果,与生物信息学分析结果进行对比,排除假阳性,检测候选hsacirc0006215表达情况,通过RT-qPCR检测各组织中miR-378a-3p表达情况,通过Western blot检测靶基因蛋白SERPINA4表达情况。收集正常人血液50例,胰腺癌患者血液50例。通过RT-qPCR检测血液中hsacirc0006215表达情况。培养胰腺癌细胞系PANC-1,细胞系PANC-1可分为三组,分别为过表达组,沉默组,正常组。利用RT-qPCR检测胰腺癌细胞系PANC-1中hsacirc0006215表达情况;利用RT-qPCR、Western blot等方法检测上调hsacirc0006215及下调hsacirc0006215后各组细胞中miR-378a-3p及SERPINA4表达情况。利用CCK-8检测细胞的增殖能力;利用流式细胞技术（FCM）检测细胞的凋亡率;利用Transwell实验检测细胞体外的侵袭能力。结果:利用高通量测序对胰腺癌组织及胰腺癌旁组织进行了全面深入的测序分析,基于Illumina技术测序平台,每个样本有效测序深度不低于200X;并利用软件Target-human-GJT对产生的测序数据进行生物信息学分析筛查circRNA表达谱,筛选出特异性较高的hsacirc0006215-miR-378a-3p-SERPINA4互作网络。RT-qPCR验证结果显示:hsacirc0006215在胰腺癌组织中较胰腺癌旁组织中表达是升高的,而miR-378a-3p在胰腺癌组织中较胰腺癌旁组织中表达的是降低的,SERPINA4在胰腺癌组织中较胰腺癌旁组织中表达升高,hsacirc0006215在胰腺癌血液中较正常人血液中表达升高,差异有统计学意义（P<0.05）。CCK-8结果提示与正常组相比,过表达组细胞增殖能力升高,沉默组增殖能力下降,Transwell结果提示与正常组相比,过表达组侵袭能力升高,沉默组侵袭能力下降,流式细胞技术（FCM）结果示与正常组相比,过表达组细胞凋亡能力减弱,沉默组细胞凋亡率升高;RT-qPCR,Western blot等方法检测结果示过表达组中hsacirc0006215、SERPINA4较正常组表达升高,沉默组较正常组下降,过表达组中miR-378a-3p较正常组表达下降,沉默组较正常组表达升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:本研究利用目前最新的高通量测序技术检测胰腺癌样本,筛查出了胰腺癌中差异性circ RNA的表达谱,找到circRNA-miRNA-m RNA之间互作关系对胰腺癌的影响;以hsacirc0006215为候选circRNA,通过组织验证实验、体外细胞验证在胰腺癌异常表达,候选hsacirc0006215-miR-378a-3p-SERPINA4的互作网络在胰腺癌发生发展中的作用,为胰腺癌发生机制提供崭新理论视角,也将为诊断和治疗胰腺癌奠定了良好的理论基础。