类固醇生成因子1(Steroidogenic factor 1,SF-1/NR5A1),是核受体超家族中一个调控类固醇生成,对性腺发育,性别决定与分化必不可少的重要转录因子。SF-1高表达于类固醇生成组织中。它的靶基因几乎涵盖下丘脑-垂体-性腺轴的所有成员,以及许多涉及肾上腺类固醇生成的基因。完全敲除SF-1会导致肾上腺和性腺不能形成、表现出由雄向雌的性逆转、垂体促性腺激素分泌细胞功能的损伤以及下丘脑腹内侧核的缺失。因此,SF-1对肾上腺、性腺的发育以及性别决定与分化是必需的。由于缺少特异性的抗体和其他技术限制,sf-1在鱼类的研究仅限于分子克隆、mRNA的表达、原位杂交以及体外实验。在硬骨鱼类中仍然没有Sf-1蛋白表达和缺失功能的报道。CRISPR/Cas9基因靶向敲除技术是近年来发展起来的最具优势的一种基因组编辑技术。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是一种世界性的养殖鱼类,雄鱼比雌鱼生长快50%,单性全雄鱼养殖具有较高的经济价值。在本研究中,我们制备了Sf-1的多克隆抗体,用免疫组化的方法分析了Sf-1在尼罗罗非鱼性腺中的表达模式。用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术产生了sf-1的突变体并分析了F0和F1突变体性腺表型、基因表达、血清雌二醇(estradiol-17β,E2)和11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT)的水平。研究结果如下:1)Sf-1在性腺发育过程中的表达模式和细胞定位。转录组分析表明,sf-1在孵化后(dah)5天便在性腺中表达,且XY表达高于XX,从30 dah开始表达上调并在成熟精巢中一直维持高表达状态。在XX性腺中,sf-1表达上调并在30 dah达到最高水平,在90 dah下调至非常低的水平并且维持这种水平直到180 dah。通过制备Sf-1多克隆抗体,用Western blot验证其特异性,与计算的分子量大小一致的罗非鱼Sf-1抗原C端片段(35.88kDa)和天然蛋白(55.01kDa)被Sf-1抗体识别出来,证明抗体工作特异。通过免疫组化的方法检测到Sf-1表达在生殖细胞的细胞质以及体细胞的细胞质与细胞核中,在卵巢表达于卵原细胞、Interstitial(间质)细胞、Granulosa(颗粒)细胞和theca(鞘膜)细胞,且证实sf-1和雌激素合成关键酶cyp19a1a通常共表达于interstitial细胞、granulosa细胞和theca细胞中;sf-1在精巢表达于的精原细胞和leydig(莱氏)细胞,且与雄激素合成关键酶cyp11b2共表达于leydig细胞。2)用crispr/cas9靶向高效突变sf-1,在f0代导致性腺发育缺陷、肥满度增加和高存活率、8.1%的xx鱼甚至出现由雌向雄的性逆转。通过提取注射后两个位点的各20个胚胎混合样以及90dah突变体尾鳍中基因组dna,pcr扩增敲除位点两段片段然后酶切检测的方法进行突变分析。在对照组中,用限制性内切酶bmri和bcodi完全的酶切分别产生151bp和321bp,以及247bp和315bp两个片段。在注射了cas9mrna和目标grna的胚胎中观察到一个未切开的dna片段,证明crispr/cas9系统成功导致sf-1突变。在混合胚胎样中突变率在位点1和2中分别达到90.9%和82.1%。在突变位点1和2胚胎中测序鉴定出移码突变的频率分别接近70.6%和76.9%,其余为非移码突变。突变位点1和2的孵化率分别为52.1%和53.5%,显著的低于对照组71.0%。敲除位点1筛选的结果显示,显微注射的鱼中94.7%的xx和94.8%的xy是突变体,敲除率在72%到95%之间。大部分sf-1突变的f0代xx和xy鱼表现为性腺发育缺陷(gonadaldysgenesis,gd),性腺非常细小,类固醇生成细胞的减少且生殖细胞减数分裂停滞。gdxx性腺主要充满了体细胞和卵原细胞,伴随未充分发育的卵巢腔,gdxy性腺主要由体细胞和精原细胞组成,伴随未充分发育的输精管。然而8.1%的sf-1突变xx鱼呈现出由雌向雄的性逆转并有一个尾端短而粗的性腺(sf-1deficientxxmale,srm),观察到类固醇生成细胞、精原细胞、精母细胞和精子细胞。与对照组相比,sf-1突变也导致xx鱼的雌激素合成关键酶cyp19a1a,雌性通路重要基因foxl2的表达和血清雌激素e2水平的下降;xy鱼的cyp19a1a、foxl2表达的上升和雄激素合成关键酶cyp11b2的表达和血清雄激素11-kt水平的显著下降。在位点2的敲除鱼中也检测到相同的表型与基因表达模式。在srm鱼性腺中,检测到cyp11b2但是没有检测到cyp19a1a,血清11-kt水平显著性高于对照组xx和xy鱼,但是e2水平显著低于xx鱼却高于xy鱼。与对照组相比,sf-1突变也导致gdxy鱼体重、肥满度和存活率显著增高。3)e2部分、mt完全回救sf-1突变的xx与xy性腺表型。组织学观察显示,高低两个浓度的e2处理只能部分回救gdxx(egd)性腺的发育,主要表现为出现了ii时相的卵母细胞和卵巢腔。但是mt处理gdxy可以完全恢复精巢尺寸,有些甚至表现为肥大的性腺,主要表现为出现了精母细胞、精子细胞和输精管中游离的精子。在mt回救的性腺中出现了很多的空泡。用荧光免疫组化的方法检测未发现cyp19a1a和cyp11b2在e2与mt回救组性腺中表达。用免疫组化的方法检测对照组、gd和mgd的xy鱼的基因表达发现,与对照组xy鱼相比,在gd的xy性腺中,dmrt1仍高表达于sertoli(支持)细胞,而amh零星的表达于myoid(叶边)细胞和Sertoli细胞。在MGD性腺中,只有零星的Dmrt1表达于Sertoli细胞,但并没有Amh表达。qRT-PCR结果表明dmrt1表达于GD性腺并且与对照组XY性腺无显著差异。然而,GD XY性腺的amh表达与对照组XY相比显著下调。GD XY性腺的sf-1表达显著性的低于对照组XY但高于对照组XX。总的来说,雄性通路的基因在GD XX性腺中维持一个低的未改变的水平,但在GD XY性腺中下调。4)Sf-1突变杂合子导致由雌向雄的性逆转。通过MGD XY♂与野生型XX♀杂交产生杂合子sf-1+/-。与MGD体细胞有多种突变类型不同,在精子和F1代中只检测到其中的两种突变。通过PAGE对产生的F1代鱼进行基因分型,由于其父本的高敲除率导致F1代全都是sf-1+/-杂合突变体,在一个等位基因上携带有删除11和7个碱基的突变导致Sf-1蛋白在铰链域截断。统计数据表明,在检测的80条sf-1+/-F1鱼中,有42条是XY另外38条是XX。所有的XY与都发育成雄性,但是在38条XX鱼中,有35条表现为由雌向雄的性逆转,剩下的3条鱼为卵巢发育缺陷的雌性。在90 dah全部的sf-1+/-XX和XY精巢都表现出精子发生延迟、输精管形成紊乱,但在150 dah恢复正常,产生的精子可育。且在sf-1+/-XX和XY鱼精巢Leydig细胞中表达Cyp11b2但不表达Cyp19a1a。5)Sf-1突变杂合子性腺表现出与对照组雄鱼相似的类固醇基因表达模式。通过qRT-PCR、Western blot及血清E2和11-KT水平检测sf-1+/+XX和XY、sf-1+/-XX和XY。结果显示,在90 dah,cyp19a1a/Cyp19a1a在sf-1+/+XX性腺的表达及血清E2水平显著高于sf-1+/+XY、sf-1+/-XX和XY鱼,而后三者之间没有显著差异。相反,cyp11b2/Cyp11b2在sf-1+/+XX性腺的表达及血清11-KT水平显著低于sf-1+/+XY、sf-1+/-XX和XY鱼,且后三者之间也没有显著差异。此外,Sf-1高表达于sf-1+/+XY精巢,中度表达于XX卵巢,低表达于SRM、sf-1+/-XX和XY精巢。综上所述,本研究制备了罗非鱼Sf-1的多克隆抗体并研究了Sf-1蛋白在性腺中的表达,用CRISPR/Cas9技术突变Sf-1获得F0代突变鱼和F1代杂合子。与哺乳动物模型中的结果一致,Sf-1突变阻断类固醇生成,产生性腺发育缺陷并增强了身体的生长。此外,我们还证明Sf-1突变的XX与XY鱼性腺发育缺陷可以分别被E2处理部分回救,MT处理完全回救并产生可育的精子。发现sf-1+/-的杂合子表现为由雌向雄的性逆转。支持Sf-1在鱼类也是调节类固醇生成、对性腺发育及性别分化所必需的重要因子。本研究不仅丰富了我们对非哺乳类脊椎动物特别是硬骨鱼类性别决定和分化分子机制的认识,也为罗非鱼的性别控制提供了理论依据。