第一部分：乳腺癌耐药细胞株体外模型的建立及其耐药机理研究肿瘤细胞的多药耐药性（Multidrug resistance，MDR）是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药的同时，对其它结构和作用机理不同的抗癌药物亦产生交叉耐药。MDR的原因是复杂的，但MDR1基因过度表达产生的P—糖蛋白（Permeability glycoprotein，P-gp）是MDR产生的最重要原因。本实验拟针对P-gp介导的多药耐药现象，建立人乳腺癌细胞系MCF-7的耐药细胞株，以便为探讨乳腺癌细胞MDR的发生机制，并探寻逆转MDR的有效方法和药物提供理想的体外实验模型。方法：通过阿霉素浓度梯度诱导法逐步培养出MCF-7的耐药细胞株MCF-7／ADM。MTT法测定并比较阿霉素（ADM）对MCF-7细胞和MCF-7／ADM细胞的IC₅₀；通过罗丹明123滞留实验比较MCF-7细胞和MCF-7／ADM细胞内罗丹明123荧光强度的差别；RT-PCR和流式细胞仪比较MCF-7细胞和MCF-7／ADM细胞内mdr1 mRNA表达及P-gp表达的不同。结果：历时6个月，成功培养出MCF-7的耐药细胞株MCF-7／ADM。MCF-7／ADM细胞的ADM IC₅₀为65.43±3.94μM，显著高于MCF-7细胞的ADM IC₅₀-1.12±0.14μM（P＜0.05），两者相差约58倍；培养体系中加入等量罗丹明123，MCF-7／ADM细胞罗丹明123荧光强度为（1.22±0.20）％，显著低于MCF-7细胞罗丹明123荧光强度（97.67±1.01）％（P＜0.05），两者相差约80倍；RT-PCR法显示出MCF-7／ADM细胞内mdr1 mRNA高表达，MCF-7细胞内mdr1 mRNA没有表达；流式细胞仪测定MCF-7／ADM细胞内P-gp表达为99.80％，而MCF-7细胞内P-gp表达为53.70％，两者相比有显著差异。结论：MCF-7／ADM细胞具有典型的MDR现象，其产生MDR的机制主要为MDR1基因过度表达，导致P-gp过度表达，从而使细胞内药物浓度减少。此耐药细胞株的建立为进一步研究肿瘤细胞多药耐药的发生机制和研究逆转耐药方法提供了理想的实验工具。第二部分：人参皂甙Rh₂对MCF-7及MCF-7／ADM的抑制作用研究目的：近年来，人们逐渐认识到促进肿瘤细胞的凋亡是恶性肿瘤治疗的新目标。大量研究表明，单味中药的有效成分及复方制剂在诱导肿瘤细胞凋亡中可以起重要作用。人参（PanaxginsengC．A）为五加科多年生草本植物，其成分具有诸多生物活性，人参皂甙Rh₂是由人参中提取的天然活性成分。大量研究证明Rh₂具有非常显著的抗肿瘤作用，其抗肿瘤药理作用值得深入的研究。本研究拟以人乳腺癌细胞系MCF-7为受试对象，旨在研究Rh₂在抑制MCF-7和MCF-7／ADM细胞增殖方面的作用及机理。方法：不同浓度Rh₂分别作用于MCF-7及MCF-7／ADM细胞，应用MTT法确定各组细胞在24小时、48小时和72小时三个时间点的增殖抑制率；通过流式细胞仪检测Rh₂对MCF-7及MCF-7／ADM细胞坏死、凋亡和细胞周期的影响；并检测Rh₂对MCF-7及MCF-7／ADM细胞caspase3活性的影响。结果：5～80μmol／L Rh₂可以显著抑制MCF-7和MCF-7／ADM的增殖（P＜0.05），并有时间和剂量依赖关系；Rh₂浓度＞80μmol／L后细胞抑制率则不再随Rh₂浓度增加而上升；Rh₂对MCF-7细胞的抑制作用更强。40μmol／L Rh₂主要通过导致MCF-7细胞坏死而抑制其增殖，坏死率为（31.9±2.55）％，凋亡率为（11.33±0.66）％，（P＜0.05）；而相同浓度Rh₂作用于MCF-7／ADM细胞，则主要是通过Caspases途径诱导其凋亡，坏死率（7.28±0.20）％，而凋亡率达（26.49±2.42）％，（P＜0.05）。Rh₂对两种细胞周期的影响也有所不同：Rh₂使MCF-7细胞周期阻滞于S期，G₂／M期细胞减少；而在MCF-7／ADM细胞中，变化却相反，Rh₂导致S期细胞减少，G₂／M期细胞增多。结论：人参皂甙Rh₂通过不同机制抑制了MCF-7和MCF-7／ADM细胞的增殖：Rh₂主要通过导致MCF-7细胞坏死而抑制其增殖；而对于MCF-7／ADM细胞，则主要是通过Caspases途径诱导其凋亡。Rh₂诱导耐药细胞系MCF-7／ADM凋亡的研究结果显示其在抗肿瘤作用方面的独特性。第三部分：人参皂甙Rh₂逆转MCF-7／ADM多药耐药性的研究目的：恶性肿瘤对化疗药物的多药耐药是当今肿瘤化疗失败的主要原因，而MDR1基因过度表达产生的P-gp是多药耐药性产生的最重要原因，P-gp属于ABC（ATP-binding Cassette）转运蛋白家族的一员，是一种能量依赖性药物转出泵，能将化疗药物从癌细胞内泵出细胞外，从而使药物在细胞内积蓄浓度降低，药物的细胞毒作用降低，导致肿瘤化疗的失败。因此，寻找低毒、有效的MDR逆转剂是肿瘤化疗领域急需解决的问题。中药治疗肿瘤不仅毒副作用小，而且作用途径比较广泛。近年大量研究表明，许多单味中药的有效成分及复方制剂在体外实验中有逆转肿瘤细胞MDR的作用。本实验的研究目的为：人参皂甙Rh₂作为抗肿瘤作用非常显著的中药单体，是否具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的作用，并探寻其机理。方法：Rh₂与ADM作用于MCF-7及MCF-7／ADM细胞，72小时后，MTT法比较单独应用ADM与ADM联合应用Rh₂各组ADM IC₅₀的变化；罗丹明123加入MCF-7及MCF-7／ADM细胞，流式细胞仪分析不同浓度Rh₂和维拉帕米抑制罗丹明123外排的情况；RT-PCR法和流式细胞仪检测Rh₂对MCF-7／ADM细胞mdr1 mRNA表达及P-gp表达的影响。结果：Rh₂可以显著降低MCF-7／ADM的ADM IC₅₀（P＜0.05），40μmol／L Rh₂可使MCF-7／ADM的ADM IC₅₀下降为2.14±0.26μM，耐药倍数仅为1.91，而对MCF-7细胞的ADM IC₅₀却没有影响；Rh₂可以增加MCF-7／ADM细胞内罗丹明123荧光表达强度（P＜0.05），比维拉帕米抑制罗丹明123外排作用更强，在MCF-7细胞内Rh₂和维拉帕米均无此作用；Rh₂对MCF-7／ADM细胞mdr1 mRNA表达及P-gp表达没有影响。结论：体外实验中，人参皂甙Rh₂可以有效逆转P-gp介导的MCF-7／ADM的耐药性，是一种安全、高效的MDR逆转剂，可能成为具有广阔前景的抗肿瘤药物。