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目的:(1)建立右归丸入血成分的分析方法,初步明确骨质疏松不同证型下右归丸的主要入血成分;(2)建立右归丸含药血浆中主要入血成分的LC-MS/MS定量分析方法,进行骨质疏松不同证型下右归丸多成分的药代动力学研究,明确右归丸在骨质疏松不同证型下的药代动力学差异。方法:(1)采用LC-MS/MS技术建立右归丸药液主要化学成分的分析方法,通过对比各成分对照品、单味药、右归丸药液及空白血浆、右归丸含药血浆的色谱-质谱图,根据各成分的保留时间和提取离子流图,确定正常、骨质疏松、骨质疏松肾阳虚、骨质疏松肾阴虚4种证型大鼠灌服右归丸后的主要入血成分。(2)确定定量分析的色谱-质谱条件:色谱柱Waters Atlantis(?)d C18(3.0x150 mm,3μm),流动相:水(0.05%甲酸+5mmol/L甲酸铵)-乙腈梯度洗脱,流速:0.3mL/min,柱温:20℃,进样体积:10μL;采用ESI离子源,多反应监测(MRM),正、负离子同时扫描模式。以甲醇:乙腈(1:1)沉淀蛋白,进行专属性、线性关系、精密度、准确度、提取回收率、冻融稳定性等系统的方法学考察,建立右归丸含药血浆中12个主要入血成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、桃叶珊瑚苷、莫诺苷、马钱子苷、绿原酸、阿魏酸、松脂醇二葡萄糖苷的LC-MS/MS定量分析方法。(3)检测正常、骨质疏松、骨质疏松肾阳虚、骨质疏松肾阴虚大鼠灌服右归丸药液后不同时间点血浆样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、桃叶珊瑚苷、莫诺苷、马钱子苷、绿原酸、阿魏酸、松脂醇二葡萄糖苷等成分的浓度,采用Winnolin6.2软件计算各成分在4种证型大鼠体内的药动学参数,拟合药-时曲线,分析比较4种证型、尤其是骨质疏松肾阴虚证和骨质疏松肾阳虚证右归丸12个入血成分的药动学差异。结果:(1)正常、骨质疏松、骨质疏松肾阳虚、骨质疏松肾阴虚4种证型大鼠灌服右归丸药液,含药血浆中均分析鉴定了 20个入血成分,分别是君药附子中的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱;君药肉桂中的肉桂酸;臣药熟地黄中的梓醇、桃叶珊瑚苷,臣药山茱萸中的莫诺苷、马钱苷、没食子酸,臣药山药中的薯蓣皂苷元,臣药枸杞中的甜菜碱、原儿茶酸、原儿茶醛,佐药杜仲中的松脂醇二葡萄糖苷,菟丝子中的山奈酚、绿原酸,当归中的阿魏酸、绿原酸。(2)建立了右归丸含药血浆中12个主要入血成分的LC-MS/MS定量分析方法。正离子以盐酸小檗碱为内标,负离子以替硝唑为内标,采用加权最小二乘法回归,1/c权重系数,乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、阿魏酸、马钱苷、莫诺苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷分别在 0.0500～50.0ng/mL、0.0500～50.0 ng/mL、0.0500～50.0 ng/mL、0.0500～50.0 ng/mL、0.0500～50.0 ng/mL、0.0500～50.0 ng/mL、1.00～1000ng/mL、1.00～1000 ng/mL、1.00～1000 ng/mL、0.500～500 ng/mL、0.500～500 ng/mL、10.0～1000ng/mL 范围内,血药浓度与被测组分与内标物峰面积的比值(As/Ai)呈良好的线性关系(r均大于0.99),平均提取回收率均大于70%。(3)得到右归丸12个主要入血成分在4种证型下的药时曲线及药动学参数,4种证型下右归丸12个成分在大鼠体内的过程均符合二室模型,但不同证型下各成分的药-时曲线和药动学参数存在明显差异。右归丸补肾阳君药附子、佐药杜仲的主要成分—乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、松脂醇二葡萄糖苷在骨质疏松肾阳虚状态下AUC0-∞较大、消除半衰期t1/2相对较大,说明其在骨质疏松肾阳虚大鼠体内吸收较多,作用时间较长;而滋肾阴臣药熟地、山茱萸的主要成分—桃叶珊瑚苷、莫诺苷、马钱苷在骨质疏松肾阴虚状态下吸收、分布较大。结论:(1)本文首次研究并明确了骨质疏松不同证型下右归丸可吸收入血的化学成分,这些入血成分很可能是右归丸的体内直接作用物质,对其进行深入研究将有助于阐明右归丸治疗骨质疏松的药效物质基础及作用机制。(2)本文首次研究并建立了右归丸含药血浆中12个主要入血成分—乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、桃叶珊瑚苷、莫诺苷、马钱子苷、绿原酸、阿魏酸、松脂醇二葡萄糖苷的LC-MS/MS定量分析方法,该方法简便快速、灵敏度高、专属性强、准确可靠,可用于右归丸的药代动力学研究,亦可为临床血药浓度检测奠定基础。(3)本文首次进行骨质疏松不同证型下右归丸的药代动力学研究,结果表明右归丸补肾阳君药附子和佐药杜仲的主要成分—乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、松脂醇二葡萄糖苷在骨质疏松肾阳虚状态下吸收较多,作用时间较长,初步推测这些成分可能是右归丸补肾阳的主要功效成分;而滋肾阴臣药熟地、山茱萸的主要成分—桃叶珊瑚苷、莫诺苷、马钱苷在骨质疏松肾阴虚状态下吸收、分布较大,可能是右归丸滋肾阴的主要功效成分,为临床应用右归丸治疗骨质疏松肾阳虚证提供实验支撑,从化学层面、物质基础角度诠释中医治疗骨质疏松肾阳虚、肾阴虚证的“同病异治”、“辨证论治”的科学内涵。