背景：　　 人冠状病毒NL63是2004年发现的一种新的冠状病毒，与HCoV-229E同属于I组冠状病毒。其引起的呼吸道疾病需要住院治疗，特别是儿童、老人及免疫功能低下的成人。而且HCoV-NL63还报道与哮喘及Kawasaki疾病有关。中和抗体或者T细胞免疫反应被认为直接针对HCoV-NL63的多种蛋白，但是主要仍是棘突蛋白，所以人们认为棘突蛋白介导的特异的免疫反应在抵御其感染中起着很重要的作用。另外，棘突蛋白包含受体结合区，参与病毒的结合与进入，所以在疫苗的研究及诊断治疗的发展方面提供了重要的靶位。然而目前对HCoV-NL63棘突蛋白的表达与功能分析的报道仍十分有限，对其抗原性与免疫原性的研究仍有待深入。　　 痘苗病毒是一种双链的DNA病毒，基因组全长大约180kb。痘苗病毒天坛株在五十多年前就被成功的用于消灭天花，并且极少出现严重的副作用。通过同源重组的方法可以将较长的DNA片段插入痘苗病毒基因组而不破坏病毒的整合。痘苗病毒载体己经用于多种病原体的糖蛋白表达及功能分析，亦可直接应用于诊断抗原的制备及疫苗的研发。　　 方法：　　 一、采用pVRC真核表达载体构建了携带冠状病毒NL63棘突蛋白四个片段的表达质粒，将其瞬时转染293T，24-48h后收获细胞，进行Westernblot及免疫荧光分析证实并比较其表达情况。　　 二、采用pJSC1175痘苗病毒表达载体，构建了携带冠状病毒NL63棘突蛋白四个片段的表达质粒，并通过同源重组获得重组的痘苗病毒，感染143细胞，收获感染细胞超声裂解获得病毒，利用Westernblot及免疫荧光方法证实并比较其表达。　　 三、用真核表达质粒及痘苗病毒分别单独免疫及联合免疫小鼠，最后一次免疫后三周分离脾细胞，通过ELISPOT对细胞免疫水平进行评价。　　 结果：　　 一、HCoV-NL63S蛋白不同区段在pVRC8301真核表达载体中的表达　　 根据生物信息学及文献资料将S蛋白分段，构建分别表达S1（S蛋白的S1区前面加信号肽1-20aa，简称S1）、S2(S蛋白的S2片段去掉跨膜区，在其前面加信号肽1-20aa，简称S2)、RL(S蛋白的受体结合区前面加信号肽1-20aa,简称RL)、RS(S蛋白的最佳受体结合区前面加信号肽1-20aa,简称RS)四个基因的真核表达质粒，四个质粒分别命名为pVRC8301-S1、pVRC8301-S2、pVRC8301-RL及pVRC8301-RS。将四个质粒瞬时转染293T细胞后，24-48h后收集细胞，经Westernblot及免疫荧光验证其在细胞内均能正确有效表达。　　 二、HCoV-NL63S蛋白不同区段的重组痘苗病毒的制备及表达　　 根据生物信息学及文献资料将S蛋白分段，构建分别表达S1（S蛋白的S1区前面加信号肽1-20aa,简称S1）、S2(S蛋白的S2区去掉跨膜区，在其前面加信号肽1-20aa,简称S2)、RL(S蛋白的受体结合区前面加信号肽1-20aa，简称RL)、RS(S蛋白的最佳受体结合区前面加信号肽1-20aa，简称RS)四个基因的重组痘苗病毒质粒，通过同源重组获得相应的痘苗病毒分别命名为RVJ1175-S1、RVJ1175-S2、RVJ1175-RL、RVJ1175-RS。利用产物测序的方法证实：表达各S片段的重组痘苗病毒中，目的基因重组于TK区并位于7.5k启动子下游。Westernblot、免疫荧光检测结果显示，S蛋白各片段均可在143细胞中很好的表达，并且S1，RL及RS的蛋白荧光主要位于细胞膜上，而S2的蛋白荧光则主要分布在细胞浆。　　 三、HCoV-NL63S蛋白不同区段的免疫原性研究　　 将各表达质粒及重组痘苗病毒免疫BalB/C小鼠，分为三组：第一组四种pVRC8301质粒按照10ug/只小鼠，皮内注射加电转免疫小鼠三次；第二组四种pVRC8301质粒按照10ug/只小鼠，皮内注射加电转免疫小鼠两次，重组痘苗病毒按107PFU/只小鼠经腹腔加强；第三组四种重组痘苗病毒按107PFU/只小鼠经腹腔免疫两次，间隔四周免疫，最后一次免疫后三周分离脾细胞，ELISPOT检测分析小鼠的细胞免疫。结果显示，质粒与痘苗联合免疫组的细胞免疫反应较其他两组均强。　　 结论：　　 一、成功构建了以pVRC8301为载体的两组共8个DNA疫苗质粒。利用免疫荧光、Westernblot等方法证实各S蛋白片段均可在293T细胞中很好的表达。　　 二、成功构建了四种痘苗病毒质粒，并通过同源重组的方法获得四种重组痘苗病毒。利用免疫荧光，Westernblot等方法证实各S蛋白片段均可在143细胞中很好的表达。　　 三、成功筛选了HCoV-NL63Spike蛋白的T细胞表位，为之后进行免疫学研究奠定了基础。　　 四、通过Elispot分析免疫小鼠的脾细胞，成功的证实质粒与痘苗联合免疫组的细胞免疫水平明显高于质粒或者痘苗病毒单独免疫组。