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牙科种植技术已成为牙列缺损或缺失的重要修复方法之一，但目前仍存在种植骨愈合时间过长（3-6个月），骨代谢疾病患者（骨质疏松症、糖尿病、放疗术后等）种植骨愈合不良合，失败率较高等问题。本课题拟从促进骨修复再生的角度出发，采用非病毒转染技术构建miRNA修饰的细胞膜片，并对其体内外的成骨活性进行初步研究；在此基础上，拟将miRNA修饰的细胞膜片与微弧氧化钛种植体相复合，构建基因修饰的组织工程化种植体，为种植体的骨愈合的过程提供一个兼有细胞、细胞外基质，以及生物活性分子的微环境，并从基因水平调控骨髓来源的间充质干细胞向成骨细胞转化，从而更好地促进种植体周围的骨形成和骨结合。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定【目的】体外分离培养并鉴定rBMMSCs的生物学特性【方法】采用全骨髓贴壁法分离培养rBMMSCs，并对细胞的形态特征进行观察；采用流式细胞仪进行细胞表面标记的检测；采用MTT及克隆形成检测细胞的自我更新能力；通过体外成骨、成脂诱导分化实验检测细胞的多向分化潜能。【结果】全骨髓贴壁法分离培养的rBMMSCs，显微镜下呈梭形或三角形；间充质干细胞的表面标记CD29，CD90，CD105阳性表达，而血细胞标记CD34，CD45，CD31阴性表达；克隆形成能力11.6%；成骨染色可见到钙化结节沉积，成脂染色可见脂滴的形成。【结论】(1)全骨髓贴壁法分离培养的rBMMSCs属于间充质来源的细胞，且具有自我更新多和向分化潜能。(2)该细胞可作为基因治疗的载体细胞，细胞膜片的种子细胞构建miRNA基因修饰的rBMMSCs膜片。第二部分细胞膜片基因转染的可行性探索及antimiR-138转染促进rBMMSCs膜片成骨的研究【目的】采用非病毒方法转染rBMMSC膜片的可行性进行研究; antimiR-138转染促进rBMMSC膜片成骨的研究。【方法】1）antimiR-138转染的rBMMSCs膜片的构建：采用Vc连续诱导法培养rBMMSC膜片，以Lipofectamine2000为载体，通过调整miRNA的用量及转染步骤对rBMMSC膜片进行转染；采用荧光显微观察、流式细胞分选和miRNA-PCR方法比较各组的转染效率的差异；通过大体观察、HE染色和扫描电镜观察rBMMSCs膜片的形态。2）antimiR-138转染的rBMMSCs膜片的促成骨能力检测：采用ALP、天狼星红、茜素红染色、Real-timePCR和Western blot技术观察转染后细胞膜片成骨分化能力的差异。3）antimiR-138转染的rBMMSCs膜片的异位成骨能力检测：将细胞膜片/FDB复合物移植到裸鼠皮下，术后4-8周，分别采用Micio-CT、HE和MT染色对膜片的成骨能力进行评估。【结果】本实验结果表明，通过恰当的Lipo2000-miRNAs载体体系配比及转染步骤调整，即可将以antimiR-138为代表的miRNA的成功地转染rBMMSCs膜片中，其中150nM组的转染效率可达99%，对内源性miR-138的抑制率可达85%；并且antimiR-138的修饰显著提高了rBMMSCs膜片的体外成骨活性，其中ALP、胶原、茜素红染色，Real-time PCR及Western blot检测成骨相关基因和蛋白的表达均表明实验组膜片的骨向分化能力较两对照组明显增强；体内异位成骨能力检测表明，实验组移植复合物在术后4周时已经开始有新骨再生，8周时，新生骨不断改建并矿化成熟；而两对照组直到术后8周时才有少量新生骨形成。即antimiR-138转染的rBMMSCs膜片可显著促进并加速骨组织形成。【结论】（1）通过对以Lipofectamine2000为载体的转染复合物进行适当的优化，可以构建出具有较高转染效率，良好的细胞相容性以及结构完整的antimiR-138修饰的rBMMSCs膜片。（2）在体外，antimiR-138可通过激活ERK1/2信号通路有效促进rBMMSCs膜片的成骨分化；在体内，antimiR-138转染的rBMMSCs膜片可显著促进并加速骨组织形成。第三部分antimiR-138/rBMMSCs膜片种植体复合物的构建及其骨诱导能力研究【目的】构建antimiR-138/rBMMSCs膜片微弧氧化钛种植体；antimiR-138/rBMMSCs膜片微弧氧化钛种植体的成骨活性和骨诱导能力研究【方法】1）将antimiR-138转染的rBMMSCs膜片与微弧氧化钛种植体相复合构建基因修饰的组织工程化种植体，并对其表面形貌进行扫描电镜观察。2）采用ALP、天狼星红、茜素红染色、Real-timePCR和Western blot技术检测antimiR-138/rBMMSCs膜片微弧氧化钛种植体的体外成骨活性。3）通过异位成骨实验，采用Micio-CT、HE和MT染色，免疫荧光技术对antimiR-138/rBMMSCs膜片微弧氧化钛种植体的骨诱导能力进行评估。【结果】antimiR-138转染的rBMMSCs膜片可成功与微弧氧化钛种植体复合，电镜观察亦可见丰富的细胞和胞外基质与种植体多孔结构的表面形成紧密的粘附与嵌合，即构建基因修饰的组织工程化种植体是可行的。体外ALP、胶原、茜素红染色，Real-timePCR及Western blot检测成骨相关基因和蛋白的表达均表明antimiR-138/rBMMSCs膜片与种植体的复合可促进并加速该复合物的体外成骨分化能力。体内的Micro-CT检测、HE和MT染色以及免疫荧光染色均表明antimiR-138/rBMMSCs膜片种植体复合物具有强大的骨诱导能力。【结论】(1)将antimiR-138修饰的rBMMSCs膜片与微弧氧化钛种植体复合，构建基因修饰的组织工程化种植体是可行的。(2)通过体内体外成骨实验证明antimiR-138/rBMMSCs膜片种植体复合物具有优秀的成骨活性和骨诱导能力。(3)这一技术将为解决临床种植骨愈合时间过长，骨代谢疾病患者种植失败率较高等问题提供新的思路和方法。