中国是世界主要海参贸易市场之一。海参因其丰富的药用和治疗功效,受到中国人和其他东南亚人的重视和广泛食用,吸引了营养学家和药理学家的高度兴趣。尽管海参具有重要的社会经济意义,但利用海参制备生物活性肽多年来一直沿用传统的方法。在传统的酶解中,像海参这样的粘性蛋白质样品（具有可变的胶原组织）,因为粘性会阻碍酶的自由移动,会导致酶解效率低下,必须依靠样品溶液的高液固比来控制蛋白质粘度,以加快酶的反应速度。结果导致,工业肽生产必然面临大量水需要被分离出引起能耗增高的严峻挑战。因此,本研究利用超声波剪切力的降粘作用,控制酶解过程中蛋白质底物的粘度。传统多肽生产过程中主要化学成分分子结构的变化均采用化学分析仪器进行检测,速度太慢,不能用于现代化生产技术的开发,为此本研究进行了基于微型红外光谱的酶解过程原位实时检测技术研究。传统酶解方法另外的挑战还包括酶的大量使用、过度的酶解反应、产物的抑制效应,这些问题严重影响了生产成本的降低、产物活性的改善、蛋白转化率的提高,为此本研究在海参多肽制备中采取了本课题组自主开发的梯度稀释补料酶解-膜分离耦合技术。主要研究工作与创新点如下:（1）评价了海参不同身体部位分离蛋白的特性。内脏、全身和体壁的蛋白质产量分别为75.49%、55.07%、50.01%。全身分离蛋白（WBPIs）具有最高的乳化稳定性（50.61min）,因其低的Lys/Arg比（0.30±0.01）而具有最强的诱导低胆固醇血症效果的能力。体壁分离蛋白（BWPIs）具有最高的乳化活性（148.22 m~2/g）和最低的堆积密度。内脏分离蛋白（VPIs）具有最高的发泡能力/稳定性、吸水能力以及必需和抗氧化氨基酸分数。谷氨酰胺（Glu）是WBPIs和VPIs中含量丰富的氨基酸,而甘氨酸（Gly）在BWPIs中含量丰富。这三个海参分离蛋白的独特之处是由于它们的组织结构和组成不同。因此,这些独特的物理化学、功能特性和结构特征可能会影响它们作为功能食品、营养食品和药物的选择和应用。（2）优化了促进海参蛋白酶解的超声波参数。在采用双频狭缝状超声波（SDFU）20/68k Hz双频组合、10 g/L底物浓度的条件下,获得了最佳超声的功率密度、处理温度和处理时间分别为150 W/L、30℃和17 min。与常规酶解相比,蛋白质转化率（PCD）、水解度（DH）、DPPH自由基清除活性（DRSA）和羟基清除活性（HRSA）分别提高了16.30%、27.43%、11.14%和12.68%。与对照组相比,随着剪切速率增加超声导致浆液表观粘度持续降低,从而增强了生物活性成分的功能特性和释放。巯基（SH）含量的增加、二硫化物（SS）含量的降低、紫外-可见光谱强度的增强、粒径的减小以及FT-IR光谱（酰胺I、II和III带）的移动都表明了超声波对海参蛋白质结构的影响。（3）研究了SDFU剪切稀释对海参蛋白质底物酶解动力学和热力学机制的影响。超声波机械剪切力对底物粘度的影响增加了蛋白质分子的平均动能,从而缩短了酶-蛋白质距离,暴露了酶驱动键,便于蛋白酶接近,从而导致酶解效率显著增加。超声波处理也确保了伴随着焓（?H）、熵（?S）和活化能（Ea）显著降低(分别为28.30±0.63k Jmol-1、-205.70±1.72 Jmol-1k-1和31.01±0.27 k Jmol-1),非自发反应的发展（+?G）,表明发生有效反应所需的能量显著减小。动力学结果表明,与对照组相比,超声粘度降低导致米氏常数（km）和活化能（Ea）分别显著下降了19.37%和38.78%,表明酶与底物之间形成了一个很大的亲和力。底物粘度与海参蛋白质转化率呈显著负相关（r=-0.865,p＜0.01）。经超声处理的样品,其α-螺旋（减少）、β-转角（减少）、β-折叠（增加）和无规则卷曲（增加）显著改变。通过固有荧光光谱强度、原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）和表面疏水性（H0）表达了超声波作用引起蛋白结构改变的程度。（4）探讨了利用光纤探针和微型近红外光谱技术对超声降粘海参蛋白质酶解反应过程进行实时原位监测的可行性。采用协同区间偏最小二乘（si PLS）算法和回归模型校准来选择变量。在化学数据和NIR光谱之间建立的校准si PLS模型导致蛋白质转化度（PCD）、肽浓度和ACE抑制活性的预测集相关系数（Rp）分别为0.9189、0.9189和0.9522,均方根误差（RMSEP）分别为2.38%、0.321mg/m L和4.91%。此外,PCD、肽浓度和ACE抑制活性交叉验证的均方根误差（RMSECV）分别为1.85%,0.249mg/m L和3.95%,相关系数（Rc）分别为0.9379、0.9379和0.9651。PCD和肽浓度的最佳光谱区域分别为946.95-999.07、1849.02-1899.98、2147.6-2198.24和2242.5-2293.05 nm,而ACE抑制活性的最佳光谱区域在1708.59-1798.01、1887.24-1976.3、2153.93-2242.5和2330.93-2400 nm之间。该模型能够实时、原位监测海参蛋白酶解反应中PCD、肽浓度和ACE抑制活性的变化。（5）研究了不同分子量海参肽的组成特征及其抗氧化和ACE抑制活性,确定出下一步酶膜耦合反应的截留分子量值。与组分5-3、3-1和＜1 k Da（分别为80.81%、76.15%和75.83%）相比,截留分子量为100-30、30-10和10-5 k Da的肽组分中的亚铁离子螯合作用较低（分别为71.74%、73.37%和75.42%）。截留分子量＜5k Da的处理样品具有更强的ACE抑制活性（IC50在0.117-0.115 mg/m L之间）。随着肽分子量的降低,疏水性氨基酸含量（Val、Ala、Ile、Leu、Thr、Phe、Gly、Pro和Met）增加,在超声处理样品中观察到的增加幅度更大。经过SDFU处理,分子量为5-3k Da样品中具有高抗氧化活性的氨基酸（Met、Tyr、His、Lys）和高ACE抑制活性的氨基酸（Lys、Arg、Pro）水平分别为11.27和20.71mg/100mg。综合上述结果,一个用于下一步酶解膜分离耦合5 k Da的截留分子量被选择。（6）研究了海参肽的酶解-膜分离耦合法（EC-MS）制备技术。进行不补料酶膜耦合（EC-MS）反应条件的优化,将优化获得的反应条件应用于梯度稀释补料（GDF）、先补料再补水（FBW）和等浓度补料（CCF）三种补料方式的试验研究。GDF、FBW和CCF 3种补料方式的蛋白质转化度（PCD）分别比传统的酶解完成后进行膜分离的生产方式提高了60.39%、46.69%和23.33%。EC-MS-GDF的多肽产量、ACE抑制活性和游离氨基酸与常规方法相比分别提高了21.93%、36.54%和4.96%,单位酶产肽量提高了7倍。EC-MS-GDF可在不超过0.15MPa的安全跨膜压力极限（TMP）的情况下,连续工作7小时从海参蛋白中生产高产量和高质量（高ACE抑制活性）的多肽。经纳滤净化后,EC-MS-GDF多肽钠含量可降低58.11%。与传统先酶解再膜分离的方法（81.6%）相比,经脱盐后的EC-MS-GDF多肽在1000-500和500 Da分子量范围内占比提高到83.77%。高温对海参多肽的抗氧化稳定性影响很小。因此,将超声辅助酶膜耦合反应（EC-MS-GDF）和纳滤净化技术集成到从具有特殊高粘度（或高固液比）的材料中生产高度稳定的脱盐生物活性肽的工业生产,将是一个可行的替代方案。