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目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是免疫介导的以慢性、侵袭性外周关节炎为主要临床表现的疾病。RA的主要病理特征是关节滑膜炎和侵蚀性血管翳的形成,最终导致关节骨质破坏及关节功能障碍。RA的病因和发病机制目前尚未完全阐明。有研究报道,钙网织蛋白(Calreticulin,CRT)可能参与了RA的发病机制。本课题组前期的研究结果表明,CRT在RA患者体内表达升高,且血清CRT水平与RA患者疾病活动度呈显著正相关。此外,既往研究和我们前期工作还显示CRT可能通过抑制T细胞凋亡参与RA的发病。本课题在以往研究的基础上,进一步探讨CRT通过促进RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)存活和新生血管形成参与RA滑膜炎症的发病机制,为揭示RA的发病机制和寻找新的治疗靶点奠定实验基础。方法:1.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测106例RA患者、75例骨性关节炎(osteoarthritis,OA)患者及80例健康对照(healthy control,HC)血清中钙网织蛋白(CRT)的含量,同时检测25例RA和22例OA患者关节滑膜液中CRT的含量。2.采用免疫组织化学技术检测RA和OA患者滑膜组织中CRT以及抗凋亡分子Bcl-XL和Mcl-1的表达,并进一步分析RA滑膜组织中CRT表达水平与Bcl-XL和Mcl-1表达水平之间的相关性。3.采用胶原酶消化法分离RA和OA患者滑膜组织中的成纤维样滑膜细胞(FLS)并进行体外培养。应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)、Western Blot以及细胞免疫荧光等技术,检测RA和OA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的表达。4.RA和OA FLS体外分离培养,加入不同浓度的人重组CRT,q RT-PCR和Western Blot分别检测FLS中Bcl-XL和Mcl-1的表达。5.评估PI3K/Akt和STAT3信号通路在CRT介导RA FLS中的Bcl-XL和Mcl-1表达上调中的作用。RA FLS体外培养,PI3K/Akt或STAT3信号通路抑制剂预孵育,然后加入人重组CRT,q RT-PCR和Western Blot检测Bcl-XL和Mcl-1的表达。Western Blot分析CRT刺激下PI3K/Akt和STAT3通路的主要信号分子在RA FLS中的激活和表达。6.采用MTT试验检测CRT对RA FLS增殖的影响;流式细胞术凋亡细胞染色检测CRT对Fas L诱导的RA FLS凋亡的影响。7.采集新生儿的脐带标本,胶原酶脐带灌注消化法分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并体外培养。加入人重组CRT,检测HUVECs产生NO的量,q RT-PCR和Western Blot检测CRT刺激下HUVECs中PI3K/Akt-e NOS的激活和表达。8.分别采用MTT试验、细胞划痕试验以及构建体外血管生成的三维模型检测PI3K/Akt-e NOS-NO信号通路在CRT介导的HUVECs增殖、迁移及管腔形成中的作用。结果:1.RA患者血清中CRT含量[(6.4±3.1)ng/ml]显著高于OA患者[(3.7±0.9)ng/ml]及HC[(3.4±1.0)ng/ml](P<0.001),而OA患者与HC组之间CRT浓度差异无统计学意义(P=0.376)。RA患者关节滑膜液中CRT含量[(6.9±3.4)ng/ml]明显高于OA患者[(3.9±0.7)ng/ml](P<0.001)。RA患者血清与关节滑膜液中CRT含量差异无统计学意义(P=0.478)。2.免疫组织化学结果显示,RA患者滑膜组织中CRT、Bcl-XL和Mcl-1均呈高表达,主要位于滑膜组织的衬里层和衬里下层、血管内皮细胞、炎性细胞及血管周围,而OA滑膜组织中CRT、Bcl-XL和Mcl-1仅见少量表达。相关性分析显示,RA滑膜组织中CRT表达水平与Bcl-XL和Mcl-1表达水平之间呈正相关(r=0.5735,P=0.0404;r=0.6200,P=0.0238)。3.QRT-PCR、Western Blot以及细胞免疫荧光检测结果均表明,RA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的表达水平明显高于OA FLS。4.不同浓度的CRT作用后,RA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的m RNA表达水平和蛋白表达水平均升高,且随着CRT浓度的增加,二者表达水平的升高呈浓度依赖性。CRT作用后OA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的m RNA表达水平和蛋白表达水平没有明显的改变。5.加入PI3K/Akt或STAT3信号通路抑制剂后,CRT使RA FLS中Bcl-XL和Mcl-1表达上调的作用被抑制。在CRT的作用下,RA FLS中PI3K/Akt和STAT3信号通路被激活,p-Akt和p-STAT3表达水平明显升高。6.Fas L处理组RA FLS发生了明显的凋亡,细胞凋亡百分比为22.67%±6.82%,CRT(10、100ng/ml)预孵育后,Fas L诱导细胞凋亡百分比明显降低,分别为8.59%±4.36%和5.97%±3.82%;CRT没有明显的促进RA FLS增殖的作用。7.不同浓度的CRT作用后,HUVECs产生NO的量呈浓度依赖性升高。在CRT作用下,HUVECs中p-e NOS被激活,p-e NOS的表达水平明显增加。加入PI3K/Akt抑制剂后,CRT介导的p-e NOS表达水平升高被抑制。CRT对HUVECs中总e NOS的m RNA和蛋白表达没有明显的作用。8.MTT试验、细胞划痕试验及体外血管生成三维模型的检测结果显示,CRT具有显著促进HUVECs增殖、迁移及管腔形成的作用,加入e NOS的抑制剂明显抑制了CRT促进HUVECs增殖、迁移和管腔形成的作用。结论:1.CRT在RA患者的血清、滑膜液以及滑膜组织中表达均升高,CRT可能通过激活PI3K/Akt和STAT3信号通路使RA FLS中抗凋亡分子Bcl-XL和Mcl-1表达上调,从而促进了RA FLS的存活,导致滑膜组织增厚和血管翳形成,最终导致炎症持久浸润。2.CRT可能通过激活PI3K/Akt-e NOS-NO信号通路诱导HUVECs发生增殖、迁移和管腔形成,提示CRT可能通过促进新生血管形成参与RA滑膜炎和血管翳形成的发病机制。