论文部分内容阅读
目的： 糖尿病是危害人类健康的全球性疾病，在中国发病率约为8％，并且仍以每年200万人的速率增加。若将糖尿病患者体内的肝细胞直接重编程为胰岛β细胞，有望解决糖尿病患者胰岛β细胞缺乏和胰岛素分泌不足的问题。本研究探索应用水流动力学基因转染方法将小鼠肝细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞的可能性，观察体内外小鼠肝细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞的效率、治疗效果和安全性。 方法： 通过改良的两步法分离、纯化原代小鼠肝细胞，用腺病毒载体将Pdx1、Ngn3和MafA导入分离纯化的原代小鼠肝细胞，对直接重编程后的细胞，qRT-PCR检测诱导后不同时间点胰岛β细胞发育标志性基因mRNA的表达，免疫荧光检测胰岛β细胞标志性蛋白的表达，ELISA检测不同浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平。利用水流动力学转染试剂通过尾静脉将Pdx1、Ngn3和MafA等转录因子导入糖尿病小鼠模型体内，动态观察小鼠血糖和体重变化；在第7、14、28、56和100天分别进行糖耐量试验，眼眶静脉丛取血ELISA检测小鼠血清中胰岛素含量变化和肝脏功能蛋白AST和ALT的变化；取小鼠肝脏组织，提取总RNA。qRT-PCR检测肝脏组织内胰岛β细胞发育标志性基因mRNA的表达，冰冻切片组织进行免疫荧光检测胰岛β细胞标志性蛋白的表达。 结果： 通过改良的原位肝细胞灌注法获得高活性、高纯度的原代小鼠肝细胞；通过腺病毒载体将Pdx1、Ngn3和MafA转录因子导入原代小鼠肝细胞。qRT-PCR检测发现，直接重编程细胞内胰岛β细胞发育相关基因的表达随着编程时间延长逐渐增强，在直接重编程后第5天，Ins1和 Ins2基因的表达达到最高峰。免疫荧光染色发现胰岛β细胞标志性蛋白insulin的表达，但ELISA检测高浓度（25Mm）葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平未见明显增高。利用水流动力学转染试剂对糖尿病模型小鼠肝细胞直接重编程，糖尿病小鼠血糖逐步降低至正常血糖水平，体重逐步增加；糖耐量实验显示随着编程时间的延长，直接重编程的胰岛素分泌细胞对血糖的的调节能力逐渐增强；小鼠肝组织冰冻切片免疫荧光染色发现肝脏有胰岛素阳性细胞，具有成团呈岛样结构；qRT-PCR检测发现肝脏组织内有胰岛β细胞发育相关基因的表达。血清 ELISA检测胰岛素分泌随直接重编程时间延长分泌增多，AST和ALT水平随时间降低，肝功能恢复至正常小鼠水平。 结论： 肝脏和胰腺共同起源于腹部前肠内胚层，利用细胞直接重编程技术将转录因子组合Pdx1，Ngn3和MafA导入原代小鼠肝细胞和糖尿病模型小鼠，可将肝细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞，编程的细胞具有可分泌胰岛素功能，可以逆转高糖血症。水流动力学的转染方式对肝脏的损伤可数天内恢复。细胞直接重编程肝细胞为胰岛素分泌细胞可作为糖尿病治疗提供了新的途径。