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目的:单萜化合物作为植物次级代谢产物萜类化合物中分子量最小,分布最广的一类,有着广泛的药理作用。砂仁是化湿类中药,阳春砂Amomum villosum Lour.是砂仁的主要来源植物。阳春砂中发挥行气化湿药理作用的主要成分是挥发油,挥发油含有较丰富的单萜化合物,其中代表性的单萜化合物有乙酸龙脑酯、龙脑和樟脑等。尽管植物萜类化合物生物合成途径的上游途径已经比较清楚,但其萜类化合物合成的下游途径,即从萜类化合物前体到具体的萜类化合物的合成途径仍不清楚。本课题对阳春砂果实发育不同时期的转录组和茉莉酸甲酯诱导的转录组数据进行了深入挖掘,筛选到若干个与阳春砂单萜下游合成途径相关的单萜合酶候选基因,其中AvTPS1可能参与从香叶基焦磷酸到龙脑、乙酸龙脑酯和樟脑等单萜化合物的合成。因此,在克隆JvTPS1的基础上,构建JvTPS1的原核表达载体,进行融合蛋白表达,以及构建真核表达载体,在烟草中进行遗传转化,为该基因在原核和真核系统中进行功能鉴定奠定基础。方法:1.通过In-Fusion和Gateway方法构建重组表达载体以重组克隆载体pLB-AvTPS1质粒为模板,用Primer Premier5.0软件设计特定的In-Fusion引物和Gateway引物,分别扩增获得相应的目的基因片段。用In-Fusion方法,将带6×HIS标签的表达载体pET-32a(+)经过NcoI线性化处理后,与JvTPS1截除质体转运肽的片段进行无缝连接,构建重组表达载体pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1。同样地,pBI121载体由XbaI、SocI双酶切线性化处理后,与完整编码区片段用In-Fusion酶进行连接,构建真核重组表达载体pBI-AvTPS1。用Gateway方法将扩增获得的AvTPS1完整阅读框片段连接到入门克隆载体pENTR中,然后通过LR交换反应连接到含有6×HIS标签的pDEST17上,构建重组表达载体pDEST17-AvTPS1。通过测序与已有的序列进行比对,验证载体构建的正确性。2.JvTPS1原核表达用热击法将构建成功的pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和pDEST17-AvTPS1转入大肠杆菌 BL21(DE3)、BL21-CodonPlus、BL21DE3(Rosetta)和 BL21(DE3)pLyS,用菌液PCR筛选阳性重组子。对含有表达载体pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1的重组BL21(DE3)和BL21-CodonPlus,以0.5mMIPTG,在37℃下诱导2h后,离心收集菌体;对含有表达载体pDEST17-AvTPS1的重组大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLyS,用ImM IPTG诱导,37℃下振荡培养4h,离心收集菌体。用超声法破碎细胞,获取蛋白,接着用SDS-PAGE进行检测。对各自含有两个表达载体的工程菌BL21DE3(Rosetta),用0.5mMIPTG诱导,37℃下振荡扩大培养,6h收集的菌体,同样方法获得蛋白后,进行Western杂交检测,用HIS的一抗孵育过夜,再与红外荧光染料标记的羊抗兔二抗孵育,洗膜后进行红外荧光显影检测杂交结果。3.AvTPST基因在烟草中的遗传转化用冻融法将构建成功的真核表达载体转化到农杆菌EHA105感受态细胞中,用菌液PCR法筛选阳性重组子。本论文使用了课题组前期获得的AvDXR(MEP途径上游关键酶基因)转基因烟草(标记为D)、AvDXR和JvXR(MVA途径上游关键酶基因)共转化烟草(标记为DH)及对应的野生型烟草(标记为C),用于遗传转化。用种子培养上述烟草的无菌苗,以无菌苗叶片为外植体,用农杆菌叶盘法进行遗传转化:烟草叶盘先用MS1培养基预培养3 d,然后用活化好的重组农杆菌侵染15 min,转移到MS2培养基进行黑暗共培养2 d,再转移到MS3培养基光照培养,至外植体分化出芽并长出4-6片叶后,转移至MS4培养基进行生根培养,期间每20 d继代一次。用植物基因组DNA试剂盒提取烟草叶片的基因组DNA,PCR检测目的基因AvTPS1、AvDXR和AvHMGR,筛选转基因烟草。结果:1.载体构建PCR检测筛选到pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1、pDEST17-AvTPS1和pBI-AvTPS1的阳性重组子。测序结果表明,pDEST17-AvTPS1与pBI-AvTPS1的插入片段的编码区与pLB-AvTPS1中目的基因的编码区完全一致,pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1与截掉信号肽后的序列完全一致。成功构建了阳春砂AvTPS1带有截除质体转运肽序列的原核表达载体pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和含完整编码区序列的原核表达载体pDEST17-AvTPS1,以及用于烟草遗传转化的真核表达载体pBI-AvTPS1。2.原核表达经过 PCR 检测,重组表达载体 pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1、pDEST17-AvTPS1 成功转入不同的大肠杆菌菌株中(见前文方法2)。经过SDS-PAGE检测显示:pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1 在大肠杆菌 BL21DE3 和 BL21-CodonPlus,以及pDEST17-AvTPS1在BL21(DE3)pLyS中表达均没有观察到肉眼可见明显的条带。但是 Western 杂交检测显示:pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1、pDEST17-AvTPS1 在大肠杆菌BL21DE3(Rosetta)中大量表达后有呈现相应目的蛋白大小的条带,且截掉质体信号肽的蛋白比完整编码区蛋白分子量小。3.AvTPS1转基因烟草的获得通过菌液PCR和质粒PCR检测,构建成功含有重组表达载体的工程农杆菌EHA105(pBI-AvTPS1/EHA105)。农杆菌浸染法获得约55株转化烟草苗,其中pBI-AvTPS1转化D株系的转化苗约有25株,pBI-AvTPS1转化DH株系的转化苗约有30株。挑选22株成长情况较好的转基因烟草,提取基因组DNA,经PCR检测,最终筛选得到11株含有AvTPS1的转基因烟草,其中AvTPS1和AvDXR双基因共转化的烟草5株,AvTPST和AvDXR、AvHMGR三个基因共转化的烟草3株,以及3株只含有AvTPS1的转基因烟草。结论:本文构建了阳春砂AvTPS1的2个原核表达载体pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和pDEST17-AvTPS1,这两个表达载体在BL21DE3(Rosetta)中诱导表达后经Western杂交检测到相应蛋白,为后续优化表达条件,获得纯化蛋白进行功能鉴定提供了基础。构建成功的真核表达载体pBI-AvTPS1在烟草中遗传转化,获得AvTPS1与2个上游关键酶基因AvDXR、AvHMGR共转化的转基因烟草,为在模式植物烟草中研究AvTPS1对萜类合成的影响以及不同途径上下游基因的相互作用提供了重要实验材料。