论文部分内容阅读
目的:在临床工作和法医学实践中,时常会遇到受害人在遭受捆绑、束缚等非法限制人身自由后发生精神损伤的情况,由于损伤机制不明确,在临床诊断、治疗及法医学诊断方面都存在很大困难。上述案件的背景均存在明确的精神心理应激,此类应激原是否可以引起精神损伤,尚缺乏科学依据。杏仁核在脑高级情感活动调节中占据核心地位,是应激的高敏感区。研究证实应激时杏仁核高抑制状态解除可以产生焦虑等一系列精神损伤症状。γ-氨基丁酸(GABA)是一种重要的抑制性神经递质,对维持杏仁核高抑制状态有重要作用。GABA_B受体基因敲除后动物出现长时间的焦虑症状,表明GABA_B受体可能参与了精神损伤。应激时杏仁核GABA_B受体表达和功能发生何种变化尚不清楚;内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是应激性损伤的亚细胞机制之一,C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)是ERS过度激活的标志性蛋白质一,因此本研究拟建立大鼠应激模型,探讨杏仁核GABA_B受体表达和膜转运情况以及CHOP在其中的作用,为阐明应激时杏仁核高抑制状态解除的机制提供实验依据,对于揭示应激与精神损伤的关系具有重要意义。方法:建立大鼠束缚应激联合冰水游泳模型。实验分为control组、束缚应激模型组(model组)、束缚应激+ERS抑制剂组(inhibitor组)和溶剂对照DMSO组。通过监测体重变化、血清儿茶酚胺的浓度等评价模型是否成功建立。应用高架十字迷宫实验和自发活动实验观察大鼠焦虑行为变化。应用免疫组化技术、western blot技术检测CHOP、GABA_B1、GABA_B2蛋白表达水平。应用免疫共沉淀技术观察CHOP与GABA_B1、GABA_B2的相互作用。结果:1.体重监测结果:与control组相比,model组大鼠体重增加缓慢。2.血清儿茶酚胺浓度:与control组相比,model组第一天即应激后第1天肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺浓度均迅速升高,其后逐渐下降,但仍较control组明显升高。3.自发活动结果显示各组大鼠运动能力无明显差别。高架十字迷宫实验结果显示,与control组相比,model组开臂停留时间百分比及进入开臂次数百分比均显著减少,inhibitor组较model组增加,提示抑制CHOP表达可以减轻大鼠焦虑样行为。4.免疫组化实验结果CHOP结果显示与control组比,model组阳性细胞数目显著增高;inhibitor组与model组比较有所降低。各组GABA_B1、GABA_B2的阳性细胞数目的变化趋势一致,即与control组相比,model组明显降低;inhibitor组与model组相比有所增高。5.Western blot实验结果(1)首先将总蛋白中核蛋白去除,检测CHOP、GABA_B1受体和GABA_B2受体的表达。CHOP的检测结果显示与control组比,model组明显增高;inhibitor组较model组有所降低。GABA_B1受体和GABA_B2受体检测结果,与control组比,model组均明显降低;inhibitor组与model组比有增高。结果提示应激引起的细胞内GABA_B1、GABA_B2蛋白表达下调与内质网应激有关。(2)进一步将蛋白分为膜蛋白和胞浆蛋白,检测GABA_B1受体和GABA_B2受体表达情况,膜蛋白两种受体表达变化一致,即与control组相比,model组明显降低(P<0.05),inhibitor组较model组明显增加(P<0.05)。胞浆蛋白GABA_B1蛋白表达变化与膜蛋白检测结果一致,而GABA_B2蛋白的检测结果显示各组无明显差异(P>0.05)。6免疫共沉淀实验结果首先将总蛋白中核蛋白去除,将control组中GABA_B1、GABA_B2受体分别沉淀下来后,检测其中的CHOP的表达水平,结果显示GABA_B2受体沉淀物中CHOP表达量明显高于GABA_B1受体沉淀物,提示CHOP主要与GABA_B2结合(P<0.05)。进一步将蛋白分为胞浆蛋白和膜蛋白进行免疫共沉淀实验,胞浆蛋白检测结果显示,GABA_B1受体沉淀物和GABA_B2受体沉淀物中CHOP的表达水平在各组间趋势一致即与control组比,model组明显增加(P<0.05),inhibitor组较model组有明显降低(P<0.05)。胞膜蛋白检测结果显示,GABA_B1和GABA_B2受体沉淀物均无CHOP表达。此结果提示,应激时,CHOP与GABA_B1、GABA_B2的相互作用增加,抑制ERS可降低CHOP与二种受体蛋白的相互作用,而且CHOP与GABA_B1、GABA_B2的相互作用仅发生在胞浆。以上各项检测结果均显示DMSO组与control组比较无明显差异。结合western blot结果和免疫共沉淀结果,提示内质网应激对GABA_B1、GABA_B2在细胞中的表达及膜转运可能均有影响,且在阻止膜转运中CHOP起着重要作用。结论:1.束缚应激联合冰水游泳可以降低大鼠杏仁核GABA_B1、GABA_B2受体表达,抑制二者的膜转运,CHOP参与了这一过程。2.CHOP主要与GABA_B2受体在胞浆结合,影响GABA_B受体的膜表达。