蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶的分离提取及其cDNA部分区域扩增

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挑选健康体大蜗牛,用pH值为7.0的0.02M Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液1:4破碎蜗牛肝脏组织,提取粗β甘露聚糖酶,经两次硫酸铵分级分离和两次聚丙烯酰胺凝胶制备电泳纯化,直接与间接ELISA法检测—β甘露聚糖酶,得到纯度均一的酶制品。SDS—PAGE鉴定该酶的分子量为37KD,比活力达到975.61U/mg,提纯倍数达5.05倍,回收率为24.84%。电泳纯化的β—甘露聚糖酶进行SDS—PAGE后,进行半干法转膜,测定该酶N—末端10个氨基酸残基序列,根据所得氨基酸序列,结合在线软件Primer5设计简并引物A,B,同时提取蜗牛肝脏总RNA,RT—PCR,应用简并引物A和B扩增出一段400bp的β—甘露聚糖酶cDNA部分区域基因片段。通过蜗牛、紫贻贝、鲍鱼、扁卷螺四种软体动物基因序列与蛋白序列比对,发现蜗牛与紫贻贝的同源性略高一些。
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