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目的： 本课题通过对中国专利（专利号ZL200510100468.9）中的融合蛋白人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ胞外区与人脂联素球部的融合基因（sTNFRⅡ-gAD）进行改造，旨在构建一种新型的双功能融合蛋白，即可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素融合蛋白即sTNFRⅡ-adiponectin。该蛋白利用脂联素能自发形成同源三聚体的特性，增加了肿瘤坏死因子受体Ⅱ与TNFα的亲和力，并通过利用富含“GC”的载体系统高效表达蛋白，同时还探索了无血清悬浮流加培养的方法，为高效、快速获取该融合蛋白的大规模悬浮流加培养工艺奠定基础。 方法： 1. 获取sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，从人脂肪组织中获取脂联素cDNA。以该基因为模版，分别得到野生型和突变型adiponectin。再以实验室之前得到的pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc为模版，扩增sTNFRⅡ，将两者融合，得到sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因。 2. 构建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表达质粒 PCR扩增目的基因sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT,构建PMD18-T克隆载体，转化入大肠杆菌进行扩增，提质粒得到大量sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT目的基因，将其酶切后分别连入PMH3、PCA表达载体，得到PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、 PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表达质粒。 3. 建立表达sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的高表达CHO细胞株 通过电转化的方法，将成功构建的表达质粒转入CHO-S细胞，经过筛选得到高表达sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的细胞株。 4. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的获取 4.1 贴壁培养 筛选出的高表达株于T75中贴壁培养，收集细胞上清，利用镍柱纯化获取目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT，透析过夜后超滤管浓缩蛋白，并通过Western-blot、考马斯亮蓝染色法鉴定目的蛋白大小。 4.2 悬浮培养初探 将T75中贴壁培养的高表达株进行B001悬浮驯化，得到适合悬浮生长的稳定高表达工程细胞株。 5. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白活性的测定通过MTT法测定sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT中和TNF-α杀伤L929细胞的活性，比较目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT、标准蛋白sTNFRⅡ-Fc以及实验室原先构建的蛋白sTNFRⅡ-gAD-Fc、sTNFRⅡ-gAD拮抗TNFα的能力的差异。 结果： 1. 成功得到sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因RT-PCR后用1.2％的琼脂糖检测结果，成功得到与预期条带大小一致的片段。 2. 成功构建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表达质粒 提质粒酶切后，用1.2％的琼脂糖鉴定酶切结果，得到条带与预期位置相符，将该质粒送测序鉴定目的基因，与NCBI上获取的基因序列比对后完全一致，提示成功构建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表达质粒。 3. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白在CHO细胞中高表达 电转染后的细胞经过单克隆化后用G418加压筛选，通过Dot-Blot筛选高表达株，经过2轮筛选后，挑选表达量高的细胞株扩增培养，能得到高表达目的蛋白的细胞株。 4. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的纯化 镍柱纯化时，目的蛋白约在120mM左右浓度的咪唑洗脱下来，纯化后成功得到目的蛋白。经过WB鉴定，目的蛋白单体大小为70KD左右，并且以多聚体的形式存在。 5. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白活性的测定 sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性，且随蛋白浓度的升高，抑制TNFα杀伤L929细胞越明显，即呈剂量依赖性。相对于标品sTNFRⅡ-Fc来说，目的蛋白活性明显较强，但活性还是低于之前实验室构建的融合蛋白sTNFRⅡ-gAD。 结论: 本实验成功构建了sTNFRⅡ-adiponectin-WT、sTNFRⅡ-adiponectin-MT真核表达载体，并在CHO细胞中得到蛋白表达，已筛选出高表达单克隆细胞株。收取细胞上清，经过镍柱纯化获得一定体积的蛋白并测得具有较好的活性。