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心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是一种临床上常见的病理生理现象。常发生于心肌组织的血流中断一定时间后再次恢复血供时，不仅未能使心脏功能恢复正常，反而加重其功能障碍和结构损伤，甚至导致不可逆的损伤。研究表明缺血再灌注可导致心肌细胞凋亡。细胞凋亡是MIRI的特征之一，并且与心肌迟发性死亡有密切关系。因此开发有效防治心肌缺血再灌注损伤及细胞凋亡的药物具有重要意义。人参皂苷Rb3及Rb2组合物（Ginsenoside Rb3and Rb2Combination,G-Rb3/Rb2）是以人参皂苷Rb3（Ginsenoside Rb3, G-Rb3）为主要成分，同时含有部分人参皂苷Rb2（Ginsenoside Rb3, G-Rb2）的组合物。G-Rb3和G-Rb2是同分异构体，具有相同的皂苷元，都有4个糖，其中3个六碳糖，一个五碳糖，不同的是G-Rb3的五碳糖是木糖，G-Rb2的五碳糖是吡喃型的阿拉伯糖，结构上差别小，理化性质相近。我们研究表明，G-Rb3对MIRI具有很好的保护作用，有可能开发成中药一类新药，但由于分离G-Rb2的工艺复杂，使开发成本明显增高，不适宜工业化生产。G-Rb3/Rb2提取工艺简化，成本降低，更适宜工业化生产，具备开发新药的条件。因此，本研究观察G-Rb3/Rb2对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并与G-Rb3进行比较，初步探讨其作用机制，为组合物的开发利用提供实验依据。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支造成心肌缺血30min，再灌注120min，建立大鼠MIRI模型，观察G-Rb3/Rb2和G-Rb3对MIRI的保护作用，比较二者作用效果；应用H2O2200μmo1/L诱导心肌细胞凋亡，观察G-Rb3/Rb2和G-Rb3对心肌细胞凋亡的抑制作用并探讨其作用机制；通过H2O2200μmo1/L诱导心肌细胞凋亡，应用PI3K特异性抑制剂LY294002，观察G-Rb3/Rb2对PI3K/AKT信号通路的影响。主要研究内容如下：1. G-Rb3/Rb2对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用1.1实验方法：通过结扎大鼠冠状动脉左前降支造成心肌缺血30min，再灌注120min，建立大鼠MIRI模型。实验共分5组：假手术组（Sham）、MIRI组、G-Rb3/Rb2（20mg/kg）组、G-Rb3（20mg/kg）组和地尔硫卓（Diltiazem，DLZ20mg/kg）组。进行如下指标检测：血流动力学（HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax）；心肌梗死面积；心肌三酶（AST、CK-MB、LDH）；氧化应激（心肌组织的SOD、MDA、GSH-Px、CAT）；炎性因子（TNF-α、IL-6）；心肌细胞形态学（光镜HE染色、电镜超微结构）；TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡；免疫组化检测心肌组织Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达；QPCR检测心肌组织Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA水平。1.2实验结果：G-Rb3/Rb2和G-Rb3均可使大鼠HR加快，明显升高SBP、DBP、LVSP和±dp/dtmax，降低LVEDP，可明显降低大鼠血清AST、 LDH、 CK-MB活性，明显降低心肌组织MDA含量，升高SOD、GSH-Px和CAT活性，降低血清TNF-α和IL-6水平，缩小大鼠心肌梗死面积，可显著改善大鼠心肌超微结构损伤，但HE染色未观察到对心肌组织病理学有明显改善作用。TUNEL结果显示，G-Rb3/Rb2和G-Rb3可明显抑制心肌细胞凋亡。免疫组化结果显示， G-Rb3/Rb2和G-Rb3能明显降低Caspase-3，Bax的蛋白表达，提高Bcl-2的蛋白表达。QPCR结果显示，G-Rb3/Rb2和G-Rb3能明显提高心肌组织Bcl-2mRNA水平，降低Bax和Caspase-3mRNA水平，使Bax/Bcl-2比值明显降低。提示G-Rb3/Rb2和G-Rb3对大鼠心肌缺血再灌注损伤均具有较好的保护作用，其机制可能与抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡有关。2. G-Rb3/Rb2对心肌细胞凋亡的抑制作用及机制2.1实验方法：应用H2O2200μmo1/L作用120min建立心肌细胞凋亡模型。向原代培养乳鼠心肌细胞中加入G-Rb3/Rb20、25、50、100、200、400、800、1000μg/mL，作用48h，以MTT法检测心肌细胞存活率，确定G-Rb3/Rb2浓度。实验分6组：正常对照组，H2O2200μmo1/L组，G-Rb3/Rb2100、200μg/mL组，G-Rb3100、200μg/mL组。各药物组预先加入药物作用24h，再加入H2O2200μmo1/L作用120min，正常对照组不加H2O2处理。进行如下指标检测：心肌细胞形态，心肌细胞存活率，LDH、GSH-px、CAT、SOD活性，MDA水平，心肌细胞凋亡率，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、FADD、Apaf-1、Cytc、FasL、Bcl-2、Bax、AKT、p-AKT蛋白表达。2.2实验结果：G-Rb3/Rb2100、200μg/mL对心肌细胞存活率无影响，确定为后续实验的给药剂量。G-Rb3/Rb2100、200μg/mL与G-Rb3100、200μg/mL均可减轻H2O2导致的心肌细胞损伤，增加细胞存活率，降低LDH活性，降低心肌细胞MDA含量，增加SOD、GSH-Px、CAT活性。G-Rb3/Rb2和G-Rb3可明显抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡，降低心肌细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性及蛋白表达，降低FADD、FasL、Apaf-1、Cytc和Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达及AKT磷酸化水平。3. G-Rb3/Rb2激活PI3K/AKT信号转导通路抑制心肌细胞凋亡3.1实验方法：应用H2O2200μmo1/L作用120min建立心肌细胞凋亡模型。实验分5组：正常对照组，H2O2200μmo1/L组，G-Rb3/Rb2组，G-Rb3/Rb2+LY294002组，H2O2+LY294002组，预先加入药物作用24h，再加入H2O2200μmo1/L作用120min，正常对照组不加H2O2处理，LY294002在加入药物前20min加入。进行如下指标检测：培养液LDH活性；蛋白免疫印迹检测心肌细胞PTEN、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Bcl-2、Bax蛋白表达。3.2实验结果：G-Rb3/Rb2能降低LDH活性，加入LY294002能使LDH活性增加，提示LY294002可抑制G-Rb3/Rb2心肌保护作用；G-Rb3/Rb2降低PTEN蛋白表达，此作用与加入LY294002无关。G-Rb3/Rb2可提高AKT、GSK-3β的磷酸化蛋白表达，加入LY294002后AKT、GSK-3β磷酸化蛋白表达明显降低，且与H2O2模型组蛋白表达比较无差异。G-Rb3/Rb2可提高Bcl-2蛋白表达、降低Bax蛋白表达，加入LY294002后Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高。4.实验结论：4.1G-Rb3/Rb2与G-Rb3对大鼠心肌缺血再灌注损伤均具有保护作用，可能与抗氧化应激、抗炎、抗心肌细胞凋亡有关。4.2心肌细胞实验表明，G-Rb3/Rb2与G-Rb3均具有抑制心肌细胞凋亡的作用，可能通过抗氧化应激，影响凋亡的内源性和外源性途径及PI3K/AKT通路抑制心肌细胞凋亡，从而发挥对心肌缺血再灌注早期损伤的保护作用。4.3G-Rb3/Rb2与G-Rb3通过降低PTEN，激活PI3K/AKT信号转导通路，提高AKT磷酸化活性，激活抗凋亡基因GSK-3β、Bcl-2，抑制促凋亡基因Bax发挥对心肌细胞的保护作用。4.4G-Rb3/Rb2对心肌缺血再灌注损伤早期的保护作用与G-Rb3相一致，提示G-Rb3/Rb2具有开发为防治MIRI新药的价值。