阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD），又称老年性痴呆（Senile Dementia），是脑神经元退变性疾病，其主要症状是进行性记忆力减退和认知障碍。随着人口结构老化，AD发病增多，目前尚无有效的治疗方法，给家庭和社会带来严重的经济和精神负担。因此，寻找有效的AD治疗方法已成为当今医学界的迫切课题。 AD的主要病理特征改变是皮质、海马等部位出现大量老年斑（senile plaques，SP）、神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs），同时大量神经元溃变坏死，其中以基底前脑胆碱能神经元丢失最为严重。迄今，临床上主要采取以胆碱能制剂为主的药物治疗，同时兼顾神经营养剂、抗氧化剂、抗炎药物、改善脑循环药物等的治疗，这些治疗手段虽然能够减轻AD的症状，但无法弥补损失的胆碱能神经元和大脑皮质以及海马的胆碱能胆碱能纤维支配，因此无法阻止痴呆症状的发展。 神经干细胞（neural stem cells，NSCs）能够自我更新，具有可塑性，当移植入中枢神经系统（central nervous system，CNS）后能够受环境因素影响分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为治疗AD等神经系统退行性变带来了新的曙光。利用神经干细胞移植治疗AD，有望能弥补替代损失的胆碱能神经元。但是，移植入非神经发生部位的神经干细胞却总容易向胶质细胞分化，往往与我们移植的目的相违背，给我们的移植治疗带来一定的难题。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一种神经营养因子，对CNS多种类型神经元具有支持和营养作用，且能调控神经元再生所需要的微环境。既往研究发现，BDNF对胆碱能神经元胞体的早期生长发育作用较明显，亦有刺激突起生长的作用。近来证实，BDNF对神经干细胞的生长、发育也存在着不可忽视的作用，其在诱导神经先祖细胞向神经元表型方向分化方面起着重要的作用。 以神经干细胞的可塑性和BDNF的作用为前提，本实验用BDNF来影响神经干细胞在体外和体内的分化过程，并首次在AD模型鼠体内观察其对移植入基底前脑的神经干细胞分化成神经元尤其是胆碱能神经元的作用，同时对神经干细胞的迁移也做了观察。具体实验过程分体外和体内两部分进行。 第一部分 BDNF对神经干细胞体外分化的影响 一、材料和方法： 取新生Sptague-Dawley（SD）大鼠的海马，机械分离后，加入DNA酶进行柔和地机械吹打，制成单细胞悬液，加入含2%B27、表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度均为10ng/ml）的DMEM/F12无血清培养基，放置在37℃、5%CO2培养箱内培养。以后每5-7天用机械分离的方法传代一次。取第3-4代形成的细胞球行巢蛋白（Nestin）、5-溴-2-脱氧尿苷（5-Bromo-2’-deoxyuridine，BrdU）免疫荧光染色，鉴定培养细胞的胚胎源性和增殖能力。离心收集第3-4代的神经干细胞球，用DMEM/F12培养基和5%胎牛血清组成的分化培养基重悬浮，以10-15个神经球/孔的密度将悬液均匀接种到预先置有涂布有多聚赖氨酸盖玻片的12孔培养板中，并分为BDNF组和对照组，每组6孔，其中往BDNF组的分化培养基中加入终浓度为20ng/ml的BDNF。每3-4天半量换液，分化培养7天后取出盖玻片，分别行神经丝蛋白（neurofilament，NF）或胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein，GFAP）免疫荧光染色验证神经干细胞的分化潜能，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染胞核以标记细胞总数，计量并比较两组细胞中分化得到的NF阳性细胞占DAPI阳性细胞总数的百分比以及NF阳性细胞最长突起的长度。数据用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。 二、结果： 1、海马神经干细胞能够在EGF和bFGF的刺激下分裂增殖，1周左右形成由数十到数百个细胞组成的克隆细胞球。第3-4代的克隆细胞球Nestin、BrdU染色呈阳性。 2、两组细胞分化后都能检测到NF和GFAP阳性细胞。 3、BDNF组的NF阳性神经元比率13.66%，高于对照组的NF阳性神经元比率9.38%（P<0.05）。 4、BDNF组的神经元突起长度146.27±26.30μm，高于对照组的神经元突起长度117.00±23.98μm（P<0.05）。 第二部分 BDNF对移植入AD模型鼠基底前脑内神经干细胞分化和迁移的影响 一、材料和方法： 成年雄性SD大鼠24只，体重220-250克，随机分成2组：①NSCs+BDNF移植组（BDNF组），12只；②NSCs移植组（对照组），12只。单侧（左侧）切断穹隆海马伞（fimbria-fornix，FF），以制备隔-海马通路损伤的AD模型鼠。动物模型建立后，即刻取BrdU标记好的神经干细胞悬液5μl（1×104个/μl）移植入损伤侧基底前脑，坐标为：前囟前0.6 mm，正中线左旁开0.6mm，进针深6.5 mm。其中用于BDNF组移植的细胞悬液中加入终浓度为100ng/ml的BDNF。每组随机选6只大鼠分别在移植后1、2、4周灌注固定，每次2只，行BrdU免疫荧光染色以检测神经干细胞在体内的存活、迁移情况。剩余每组6只大鼠在移植后2周灌注固定取脑，从移植位点冠状切面开始，前后每100μm取1张切片，共7张组成1套切片，取相邻3套切片，分别行胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）+BrdU、NF+BrdU和GFAP+BrdU免疫荧光双标染色，计数并比较两组神经干细胞在体内的分化情况。数据用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。 二、结果： 1、移植后1、2、4周，BrdU免疫荧光染色显示两组移植的神经干细胞大部分均能够在体内良好存活，并能够随着时间的推移从针道处向四周迁移。在相应的时间段，BDNF组移植的细胞迁移的最远距离要比对照组远。 2、移植后2周，两组移植的神经干细胞在体内分化后都能检测到ChAT+BrdU、NF+BrdU和GFAP+BrdU阳性细胞。 3、移植后2周，BDNF组计数得到ChAT+BrdU阳性细胞数9.3±1.9，高于对照组ChAT+BrdU阳性细胞数5.5±1.1（P<0.05）。 4、移植后2周，BDNF组计数得到NF+BrdU阳性细胞数86.0±13.6，高于对照组NF+BrdU阳性细胞数59.5±12.2（P<0.05）。 5、移植后2周，BDNF组得到ChAT+BrdU阳性细胞占NF+BrdU阳性细胞的比率10.8±0.9%，高于对照组ChAT+BrdU阳性细胞占NF+BrdU阳性细胞的比率9.3±1.2%（P<0.05）。 结论： 1、BDNF能促进新生SD大鼠海马神经干细胞体外定向分化为神经元，并且能刺激新生神经元突起的生长。 2、BDNF能促进移植入AD模型鼠基底前脑的神经干细胞分化为神经元，提高胆碱能神经元的分化比率，并且能够促进神经干细胞在体内的迁移。