中药资源是我国重要的战略资源,近年来随着中医药事业的发展和新药研发对中药材需求和品质的日益增长,导致了中药资源的紧缺和野生药材的濒危。通过发掘中药活性成分生物合成的关键基因,采用代谢工程或者合成生物学策略,设计和改造微生物菌株并构建细胞工厂实现异源合成是一种极具潜力的资源获取方法,为中药资源的可持续利用提供了新的思路和发展机遇。萜类化合物是许多中药发挥药效的一类活性成分,为了构建高效、高产的萜类化合物细胞生产工厂,研究人员利用现代基因编辑技术优化了萜类前体的合成、平衡代谢通路使代谢流导向目标产物合成路径、异源表达萜类氧化修饰关键酶细胞色素P450等策略实现了萜类化合物的高效生产,并通过寻找限速步骤,结合基因组学和代谢工程相关知识,构建了具有突破性改造策略的工程菌进一步来提高工程菌中萜类化合物的积累。本研究针对萜类生物合成及积累的特征,以实验室前期构建的高产二萜前体GGPP底盘菌株BYHZ16为基础,利用CRISPR-CAS9技术对转录因子HAP1、辅因子供给、脂质体合成等参与萜类重要代谢的路径和基因进行改造,类胡萝卜素具有明显的颜色表征并可通过比色法快速定量,因此本研究以类胡萝卜素作为目标产物,对出发菌株BYHZ16进行改造以提高底盘前体积累、提升产物储存能力,为萜类中药活性成分工程菌构建提供高产前体的底盘菌,主要研究结果如下:1.工程改造转录因子HAP1对类胡萝卜素的产量没有明显提高HAP1在有氧条件下能够作为ERG2、ERG5、ERG11等催化FPP生成麦角甾醇的基因的直接激活因子,为了解除这种激活作用,增加萜类合成前体FPP的积累,本研究首先在高产萜类合成前体GGPP的底盘菌株BYHZ16上敲除HAP1基因,但结果显示类胡萝卜素的产量没有明显提高,猜测可能是由于菌株BYHZ16已经整合了多个前体改造策略,前体供给十分充足,HAP1基因的敲除对菌株BYHZ16的作用不明显。本研究继续在没有进行改造的野生菌株BY4741上敲除HAP1基因,由于HAP1缺失会下调HMG1的表达,而HMG1是MVA通路的关键酶之一,因此通过过表达tHMG1（截短的HMG1）来弥补HAP1缺失的副作用。本实验构建了单独敲除HAP1、单独整合tHMG1和同时敲除HAP1、整合tHMG1的这三株菌株,结果显示这三株菌株都没有出现类胡萝卜素的颜色表征,并且检测不到类胡萝卜素,推测是由于BY4741菌株的前体供给太少导致无法产生足量的类胡萝卜素,HAP1转录因子的研究有待进一步实验验证。2.优化CRISPR-CAS9基因编辑系统在酿酒酵母内的应用CRISPR-CAS9基因编辑系统在酿酒酵母内的应用涉及Cas9蛋白的表达和gRNA载体的敲除与更换,从而达到不同位点基因编辑的目的,但是Cas9蛋白作为外源蛋白在酿酒酵母内表达对细胞的生长和天然产物积累的影响尚不明确。本研究通过将Cas9蛋白整合到酿酒酵母基因组和利用载体分别进行表达,并选择类胡萝卜素和次丹参酮二烯这两种天然产物研究Cas9蛋白不同表达形式对酿酒酵母生长和天然产物积累的影响。结果表明,Cas9无论以整合基因组的形式表达还是利用载体表达,都会对酿酒酵母的生长和天然产物的积累产生不利影响。为了在基因编辑后高效敲除Cas9,避免Cas9对细胞的不利影响,本实验将Cas9构建在以氨基酸为筛选标记的载体上表达,在基因编辑完成后选择高效的负筛化合物将Cas9载体高效敲除。本实验首先比较了筛选标记Ura3负筛化合物5-FOA和Trp1负筛化合物5-FAA的负筛效率,结果表明Ura3负筛化合物5-FOA的负筛效率显著高于5-FAA,因此选择Ura3载体作为Cas9的表达载体。为了提高基因编辑效率并将Cas9对酿酒酵母的影响降到最小,本研究将Cas9表达框和gRNA表达框构建在同一 Ura3载体上,构建了质粒p416-CAS9-gRNA,并以下文脂质体改造策略中的OLE1基因为例进行过表达验证该质粒基因编辑的可行性,结果表明利用该载体能够介导OLE1基因的过表达,并且能够在基因编辑后能够将Cas9表达框和gRNA表达框高效敲除,不仅节省了氨基酸筛选标记的使用和提高了基因编辑的效率,而且避免了 Cas9蛋白对酿酒酵母生长和积累天然产物的不利影响。3.辅因子工程改造策略显著提高了类胡萝卜素的产量萜类生物合成中的关键限速酶HMGR以及萜类下游合成的CYP450的催化均需要消耗NADPH,因此针对提高NADPH量的辅因子工程能够提高酵母细胞内NADPH的合成通路,为生物合成提供供氢体,提高生物合成的催化效率。NADPH的合成高度依赖于氧化磷酸戊糖途径,本研究通过过表达葡萄糖-6-磷酸（G6P）脱氢酶ZWF1和引入糖酵解变构激活关键基因PFK1和PFK2的突变体,解除了糖酵解的刚性通量,增加了底物G6P的积累,平衡了磷酸戊糖途径和糖酵解途径,使底物G6P更多导向氧化磷酸戊糖途径,从而产生更多的NADPH。结果表明,通过辅因子工程改造虽然没有明显提高胞内NADPH/NADP+的比值,但类胡萝卜素的产量较对照组显著提高了 1.4倍,表明辅因子改造能提升萜类底盘代谢流,提高目标产物的产量,其机理有待进一步实验验证。4.脂质体工程改造策略显著提高了类胡萝卜素的产量有些萜类中药成分在细胞内积累会对细胞增殖有影响,因此产量提升困难。脂质体工程改造策略旨在提高酿酒酵母细胞内脂质代谢水平、提高脂质体的数量和体积、促进脂质体的聚集,从而提高亲脂性萜类化合物的合成和储存能力。本研究首先在整合辅因子改造策略的出发菌株上过表达了脂质体的主要成分甘油三酯（TAG）合成路径上的磷脂酸磷酸水解酶（PAH1）、甘油二酰基酰基转移酶（DGA1）、脂肪酸去饱和酶（OLE1）基因;引入乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）659和1157氨基酸位点的突变体,提高TAG的合成效率;整合了来自圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）调控脂质体大小和数量的关键基因LDP1。以类胡萝卜素为目标产物检测脂质体改造的效果,结果显示,改造后的工程菌在共聚焦显微镜下观察到有大脂滴的形成,比色法检测表明类胡萝卜素的产量较对照组显著提高了 1.3倍,表明脂质体改造策略有效。本研究采用代谢工程策略,优化了 CRISPR-CAS9编辑系统在酿酒酵母内的应用,构建了单质粒基因编辑系统p416-CAS9-gRNA,并以此作为工具对出发菌株BYHZ16进行改造。结果表明,提高酿酒酵母细胞内辅因子供给、改善脂质代谢能显著提高酿酒酵母内类胡萝卜素的生产水平。本实验工程菌的构建,为其他萜类中药活性成分的生产研究提供了底盘和参考,并且为未来寻找限速步骤,挖掘具有突破性的改造策略奠定了基础。