【摘 要】
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目的:发育期尼古丁暴露与许多子代发育不良有关。小胶质细胞在脑发育的整个阶段都发挥着重要作用。目前尚不清楚尼古丁在神经发生过程中对小胶质细胞的发育有着怎样的影响?这种影响进而对神经干细胞的发育又会产生何种作用?本研究拟通过建立母亲尼古丁暴露小鼠模型,从个体、组织及分子水平,探讨母亲尼古丁暴露对子代海马小胶质细胞极化、神经干细胞发育、及小鼠神经发育的影响及机制。为育龄期女性戒烟和尼古丁发育毒性提供科学
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目的:发育期尼古丁暴露与许多子代发育不良有关。小胶质细胞在脑发育的整个阶段都发挥着重要作用。目前尚不清楚尼古丁在神经发生过程中对小胶质细胞的发育有着怎样的影响?这种影响进而对神经干细胞的发育又会产生何种作用?本研究拟通过建立母亲尼古丁暴露小鼠模型,从个体、组织及分子水平,探讨母亲尼古丁暴露对子代海马小胶质细胞极化、神经干细胞发育、及小鼠神经发育的影响及机制。为育龄期女性戒烟和尼古丁发育毒性提供科学依据。方法:1.造模及神经发育指标和行为学测定:7周大C57BL/6雌鼠及雄鼠3:1配对。雌鼠在与雄鼠交配前2周开始分别自由饮用200μg/ml尼古丁溶液和1%糖精钠溶液。小鼠出生后对其早期神经发育指标（睁眼时间、嗅觉反射和听觉反射等）进行检测。出生20天后,每窝随机挑选2-4只用于旷场试验。2.基因水平检测:两组各取3只小鼠脑海马行全基因组芯片微阵列分析,两组之间的差异表达基因经p≤0.05和Fold change≥1.5限定;并对差异表达的基因行pathway分析和GO分析。通过qPCR检测（CXCL10,BDNF,JUNB,CCL12,IL-1β,IL-4）等基因的表达水平。3.组织学检测:PD20小鼠经心脏灌流固定取脑,经石蜡切片机行海马冠状切片,片厚5μm,尼氏染色检测神经元和胶质细胞的变化;经冰冻切片机行海马冠状切片,片厚30μm,行Iba1免疫荧光染色;Iba1/BDNF双标免疫组化染色检测小胶质细胞和BDNF的共标情况;Tuj1免疫组织化学染色检测海马神经突的长度及形态;免疫荧光化学法检测小鼠海马NeuroD1的水平;Western blot定量分析PD20小鼠海马内小胶质细胞标记物Iba1、BDNF及突触相关蛋白PSD95和GAD1的表达水平。4.细胞学检测:原代小胶质细胞培养、纯化后,设置空白对照组,尼古丁组,LPS+尼古丁组和阳性对照LPS组。空白对照和尼古丁组分别用D-10培养基和1 0μmol尼古丁培养基处理12小时和24小时。LPS+尼古丁组先用10μg/ml LPS预处理30分钟,然后再加入D-10培养基处理12和24小时。阳性对照LPS组单独用LPS处理24小时。收集上清后,使用cytokine array来测定不同组细胞因子的表达水平。结果:1.早期神经发育指标和行为学检测结果:早期神经发育指标显示尼古丁组仔鼠的睁眼时间,嗅觉和听觉成熟时间,均明显延长;旷场试验表明:尼古丁组子代总运动距离长于对照组（P<0.001）,但不动时间（P<0.01）和中心区停留时间明显缩短（P<0.05）2.基因水平检测结果:尼古丁组有132个上调基因和163个下调基因。并且进行了BP分析,结果分别展示了上调和下调的前10个生物学进程。通过pathway分析,显示了上调和下调的前5个通路。通过GO分析差异表达的基因,显示主要包括炎性基因,神经递质和突触相关的基因。qPCR验证结果和基因芯片的结果一致。3.组织学检测结果:尼氏染色显示尼古丁组的CA1胶质细胞增加,CA3和DG无明显差异;荧光染色显示尼古丁组海马M2型小胶质细胞数量增多,但NeuroD1表达减低;免疫组化双染结果显示,尼古丁组Iba1+BDNF-和Iba1+BDNF+细胞表达均增高;Tuj1单染结果显示,尼古丁组海马神经元的轴突明显延长。Western blot显示尼古丁组子代小鼠海马Iba1、BDNF和突触后膜蛋白PSD95表达增高（P<0.05）。4.细胞学检测结果:尼古丁明显抑制了由LPS引起的抗炎细胞因子的下调,促炎细胞因子的上调。结论:本研究结果显示母亲尼古丁暴露的子代表现为神经发育延迟,且表现为焦虑样行为;海马抗炎因子上调,促炎因子下调;母亲尼古丁暴露促进仔鼠海马小胶质细胞向M2型极化,BDNF表达上调;NeuroD1表达减低。体外实验也表明尼古丁促进小胶质细胞分泌抗炎因子。这些数据表明,母亲暴露于尼古丁使子代海马小胶质细胞向M2型极化并分泌BDNF及抗炎细胞因子,这与子代神经发育不良有关。图[17]表[1]参[81]
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