【摘 要】
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该论文阐述了木霉甘露聚糖酶Man1的克隆及其在毕赤酵母表达体系中的表达.首先用PCR扩增了Man1的全长基因,经过酶切论证后,交其插入pPIC9K质粒中,构建表达载体.然后转化大肠杆
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该论文阐述了木霉甘露聚糖酶Man1的克隆及其在毕赤酵母表达体系中的表达.首先用PCR扩增了Man1的全长基因,经过酶切论证后,交其插入pPIC9K质粒中,构建表达载体.然后转化大肠杆菌DH5α.通过菌落PCR验证正向插入子,然后富集培养,抽取质粒.表达质粒用SacI线形后,电转化毕赤酵母GS115得到重组菌.Congo Red平板筛选到12株有正常酶活性的表达,在特异底物的平板上有清晰的水解圈,对照GS115则不产生水解圈.通过提取重组菌的总DNA作为模板,以设计的克隆引物进行PCR扩增得到阳性结果,用出发菌株Trichoderma reesei总DNA作为模板得到的克隆片段大小和重组菌结果一致,而以GS115总DNA作为模板在同样条件下结果为阴性,从而确证基因的导入.SDS-PAGE凝胶电泳显示出该蛋白质的大小在45kDa左右.将其cDNA克隆连接到载体中表达,其活性和全长基因克隆的一致,说明酵母细胞能够正常剪切该基因内部的两个内含子,表达有正常活性的酶分子.基因工程菌避免了丝状真菌的各种毒素的潜在威胁,在使用上安全可靠.重组菌株能够进行高密度发酵,并且可以用甲醇作为单一的碳源进行生长.因此是一种比较适合生产的具有广阔前途的菌株.
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