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马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我国南方具有重要经济和生态价值的主要乡土造林树种,但受松材线虫病、马尾松毛虫等病虫害侵袭严重,导致马尾松的大量死亡,对松林资源和生态环境造成很大的破害。茉莉酸甲酯是植物体内的一种信号物质,可以诱导许多植物产生抗性。如果能通过茉莉酸甲酯诱导提高马尾松抗性,便可有效防御病虫害的侵袭,但目前对其抗性机制并不清楚。本研究用浓度为10 m M茉莉酸甲酯溶液喷施2年生马尾松幼苗,利用组织解剖方法石蜡切片观察马尾松树脂道组织结构的变化;采用GC-MS方法分析马尾松树脂萜类物质的变化;进而通过转录组测序研究诱导性萜类物质合成的分子机制,最后研究茉莉酸甲酯处理后的寄主植物对松墨天牛成虫取食相关酶系的影响,以期阐释外源茉莉酸甲酯诱导马尾松的抗性机制。1.茉莉酸甲酯处理可以诱导马尾松产生组织解剖结构的防御应答,包括多酚薄壁细胞膨胀、皮层树脂道腔隙的增大和创伤性树脂道的形成。创伤性树脂道的发育过程可划分为原始细胞阶段、胞间隙形成及腔道扩大阶段和树脂道成熟阶段。茉莉酸甲酯处理6-9天后,创伤性树脂道上皮细胞出现分化;处理后9-21天,原始细胞团中央的细胞壁中层膨胀并逐渐溶解,细胞壁分离形成间隙;处理后21-45天,24天已出现成熟的创伤性树脂道。马尾松的防御应答与茉莉酸甲酯的浓度有关,本研究中用分别用浓度为0.1 m M、1 m M、10 m M茉莉酸甲酯处理马尾松,各浓度处理的创伤性树脂道数量均逐渐增加。10 m M浓度处理后,创伤性树脂道数量增加明显且与0.1 m M和1 m M处理后的创伤性树脂道数量均存在显著差异(P<0.01)。1 m M与0.1 m M处理相比,创伤性树脂道形成较早,两者在30天后增加的数量趋于平缓。2.通过GC-MS方法,可以得到的单萜种类有10种,分别是α蒎烯,莰烯,(1S)-(-)-β-蒎烯,月桂烯,水芹烯,萜品油烯,芳樟醇,左旋樟脑,乙酸芳樟酯,L-乙酸冰片酯;得到的倍半萜有4种,分别为(-)-α-蒎烯,长叶烯,石竹烯,α-葎草烯;得到的双萜有7种,分别为1-Phenanthrenecarboxylic acid,左旋海松酸,海松酸,松香酸,新枞酸,棕榈酸,新松香酸。整体上,茉莉酸甲酯处理马尾松后的30天内,处理组萜类物质的含量要比对照组高,且处理组在0-3天和15-21天会出现明显的峰值,前一个峰值可能是树脂道存储的松脂在受到茉莉酸甲酯刺激后大量释放所致,第二个峰值可能是诱导形成的创伤性树脂分泌所致。3.本研究利用Illumina HiSeq测序平台对茉莉酸甲酯喷施后9天、21天后的马尾松进行测序,在默认参数下利用Trinity进行序列组装,共获得Raw reads 592784492个。将transcripts聚类,与Nr,Swiss-Prot,KEGG,COG及GO各数据库进行比对获得374905条unigenes,N 50长度为950 bp,E90N50长度为1991 bp。在这些unigenes中,序列长度大于1000的有35407个,占比为12.79%。Venn分析得到茉莉酸甲酯处理后9天和21天两组样本中与次生代谢相关的差异基因共有107个,再对这107个基因进行GO、KEGG富集分析,可得GO term中萜类代谢过程、类异戊二烯生物过程、类异戊二烯代谢过程等显著富集,KEGG中萜类骨架合成、类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成及双萜生物合成等途径也呈显著富集。4.本转录组学研究在萜类合成的两个途径中共发现22个差异表达的基因,包括参与合成萜类化合物的共同前体IPP和其异构体DMAP的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR);各类型萜类直接前体GPP、FPP和GGPP的形成所需的异戊烯基转移酶,如GGPPS(geranyl geranyl diphosphate synthase),但FPPS(farnesyl diphosphate synthase)和GPPS(geranyl diphosphate synthase)未差异表达;以及最后各种萜类化合物形成所需要的单萜合酶、倍半萜合酶和双萜合酶。相对于对照,茉莉酸甲酯处理后萜类合成相关基因均为上调表达。α-松油醇合酶、柠檬烯合酶、(+)-α蒎烯合酶、α-律草烯合酶、左旋海松二烯合酶、(-)-β蒎烯合酶和(-)-α/β蒎烯合酶等在茉莉酸甲酯处理后1-3天内迅速上调表达,而(-)-α蒎烯合酶、(-)-α/β蒎烯合酶、(-)-柠檬烯合酶、1(10),5-germacradien-4-ol合酶则在处理9天及又出现明显的上调表达。5.松墨天牛持续取食用10 mM茉莉酸甲酯喷施处理后1天、3天、6天和12天的马尾松24h,结果显示,茉莉酸甲酯喷施处理后6天的处理组松墨天牛的取食量与对照组相比出现差异,其体内SOD、POD和Ach E的活性升高,而CAT、GSTs活性降低,整体与对照组间无显著性差异;松墨天牛持续取食茉莉酸甲酯处理后12天的马尾松12 h、24 h、36 h和48 h,处理组与对照组之间各类酶活性变化趋势相似;其中,SOD、CAT和GST酶活性都有不同程度的降低,而POD、Ach E则相应有不同程度的升高,但是处理与对照组间没有显著性差异。