【目的】吴茱萸为六大陈药之一,素有“陈久者良”之说,然其道理何在,则少有深究。课题组前期已对吴茱萸的谱-效-毒关系进行了系统研究,初步明确了其功效/毒性物质基础。本文拟建立基于加速试验的中药陈用研究方法,综合性状、组分、药效/毒性等指标,全面评价中药陈化过程中的质量变化;再对统一来源的吴茱萸进行陈化研究,发现其活性成分群的动态变化规律,找到功效与毒性的平衡点,系统剖析“陈久者良”的科学内涵。【方法】1、为系统探讨陈化过程中吴茱萸化学成分的变化情况,将其分为三个部位来研究,即醇提物、水提物和挥发油。采用高效液相色谱(HPLC)技术对吴茱萸醇提物、水提物同时进行指纹图谱定性和多指标定量;采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对吴茱萸挥发油成分进行指纹定性和归一化法定量。2、将来源一致的吴茱萸分为正常陈化组、加速陈化组和冰冻陈化组,分别放置于室温、37℃和-18℃环境中贮藏,按实验设计的时间节点取样,用上述分析方法进行测定,记录各组药材的外观性状、挥发油含量、组分及其含量变化,追踪上述指标在陈化期中的动态变化规律,评价陈化过程中的质量变化。3、采用经典的醋酸扭体实验和热板实验,取陈化期各关节点的吴茱萸与初始样品(第0周,-18℃冰冻)进行比较,以验证陈化前后吴茱萸镇痛效果的差异。4、采用台阶型恒温法,设置几组较高温度的加速实验,根据Arrhenius公式得到各化合物的反应常数,外推得到加速陈化相当于正常陈化的时间折算系数λ。5、综合各组试验结果,从外观性状、化学成分(指纹图谱、活性成分群)、药效(镇痛、止呕)和毒性(急性毒性、肝毒性)等方面对不同陈化期的吴茱萸进行全面评价,结合中药陈用理论,系统阐述吴茱萸“陈久者良”的科学道理。【结果】1、建立了吴茱萸醇提物和水提物指纹图谱,分别确定了33个和27个共有峰,归属了其中的23个和17个共有峰;在指纹图谱的条件下建立了吴茱萸醇提物和水提物的含量测定方法,分别定量了8个和7个活性成分;同时建立了吴茱萸挥发油成分的GC-MS方法,分析了51个挥发油成分。2、在本文研究期限内,所有药材均符合药典要求,药材质量未见显著变化。(1)外观性状方面,吴茱萸及提取液的颜色逐渐变深,刺激性气味减弱。(2)指纹图谱定性与半定量分析显示:吴茱萸醇提物中除了反式咖啡酰葡萄糖酸、隐绿原酸、咖啡酸、反式咖啡酰葡萄糖酸-γ-内酯、13、15和18号峰面积上升外,其余有机酸类、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、6、7、8和22号全部减少,喹诺酮类生物碱、14和24号保持稳定。水提物中除了咖啡酸、反式咖啡酰葡萄糖酸-γ-内酯、15和19号基本稳定外,其余有机酸类、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、6、7、8、11、14、16、17和18号峰面积全部减少。(3)多指标定量发现:醇提物和水提物变化趋势一致,绿原酸含量降低,去氢吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量上升,吴茱萸碱和二氢吴茱萸卡品碱未见明显改变。加速陈化组中芦丁和金丝桃苷含量降低,槲皮素从无到有,而正常陈化组中却未见明显变化。(4)挥发油油量显著下降,α-罗勒烯和β-罗勒烯的百分占比减少。(5)陈化期内,吴茱萸的上述观测与分析指标均呈现先快后慢的变化趋势,至第76周时,这种趋势明显变慢,进入了平台期。3、相对于空白组,各实验组均有显著的镇痛效果。醇提物的镇痛效果优于水提物。初始组(第0周)、正常组(第76周)和加速陈化组(第76周)的镇痛效果无显著差异,表明陈化前后吴茱萸的镇痛效果没有明显改变,不能判断其为平衡点。4、通过台阶型恒温法得到时间折算系数λ=1.97,即加速陈化(37℃)1年相当于正常陈化(20℃)1.97年。【结论】本实验建立了基于加速试验的中药陈用研究方法,设计了正常陈化、加速陈化和冰冻陈化,3种方法可以相互比对、验证,增加了实验结果的可比性和可靠性。在本文条件下,加速陈化相当于正常陈化的时间折算系数λ=1.97。结果表明采用模拟自然环境的加速实验来研究中药陈化过程是合理的、可行的。在一定的陈化期内,吴茱萸质量稳定,毒性和燥性得到缓和,因此,“陈久者良”有其科学道理。陈化后,吴茱萸的功效成分如吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱略有增加,燥性或毒性成分如挥发油的含量显著降低,这是吴茱萸“陈久者良”的主要内在依据。吴茱萸可能有最佳陈化期限,其最佳陈化期限研究还在进行中。