类固醇药物是仅次于抗生素的第二大类药物,在过敏性疾病、风湿性关节炎、避孕等疾病的治疗中发挥着不可替代的作用,具有广阔的应用市场。雄二烯二酮（ADD）是类固醇激素药物合成的重要前体,其可由微生物分枝杆菌转化植物甾醇获得。目前,虽然已有研究者采用代谢途径改造的手段提高分枝杆菌生产ADD的能力,但仍然存在底物转化率和产物得率均较低的问题。分析其原因可能是底物溶解度较低,细胞对甾醇的摄取能力不强,以及菌株代谢工程改造与调控仍不够有效。因此,本论文筛选了分枝杆菌内源性表达元件,敲除与细胞细胞壁合成有关的β-酮酰基酰基载体蛋白合酶基因并利用高强度表达元件对甾醇代谢相关基因进行单一增强表达和异源表达透明颤菌血红蛋白基因,探究影响菌株合成ADD能力的限制性因素。在此基础上,组合表达对ADD浓度提高较为显著的因素,构建高产重组菌株,并通过转化工艺的优化进一步提高重组菌株生产ADD的能力。本论文的主要研究结果如下:（1）分枝杆菌内源性表达元件的筛选。根据分枝杆菌基因转录组水平数据,并结合启动子在线预测网站BDGP,筛选内源性表达元件。筛选出的分枝杆菌内源性表达元件进行特征序列分析以及强度表征,结果表明:获得的23个内源性表达元件皆具有细菌保守的-10区和-35区,其中有两个表达元件强度高于已报道的hsp60强表达元件,为分枝杆菌关键酶基因的表达调控提供了分子元件库。（2）分枝杆菌细胞壁合成关键酶β-酮酰基酰基载体蛋白合酶基因KasB的敲除。KasB基因与分枝杆菌的细胞壁合成有关,敲除KasB基因可提高细胞对底物植物甾醇的摄取速率。本研究利用传统敲除方法对新金分枝杆菌LY-2的KasB基因进行基因敲除,并对突变菌株进行生长及ADD生产特性研究。结果表明突变菌的生长状况并未受到影响,ADD的浓度也由3.51 g/L提高至4.25 g/L。（3）分枝杆菌中ADD合成限速关键酶的确定和透明颤菌血红蛋白基因（vgb）的异源表达。在新金分枝杆菌LY-2中,利用高强度表达元件分别对甾醇代谢关键酶基因胆固醇氧化酶（chom）、C27单加氧酶（smo）、羟酰基辅酶A脱氢酶（hsd4A）、3-甾酮-Δ1-脱氢酶（kstd）、丙酰辅酶A羧化酶（pcc）、prp操纵子的转录激活因子（prp R）和调节因子NADH脱氢酶的辅助因子（ndh）进行单一增强表达,探究新金分枝杆菌合成ADD的限速步骤。结果表明除了chom和smo外,其他关键酶基因和调节因子的增强表达均对ADD浓度的提升具有一定促进作用。其中hsd4A和pcc的增强表达显著提高了重组菌株生产ADD的浓度,分别为4.43 g/L和4.30 g/L,较原始菌株提高了26.21%和22.5%。在新金分枝杆菌LY-2中异源表达透明颤菌血红蛋白能够有效缓解分枝杆菌的溶解氧限制。当以10 g/L的植物甾醇作为底物时,vgb异源表达菌株的ADD浓度达到4.42 g/L。（4）高产ADD重组菌株的构建及工艺优化。为进一步提高ADD浓度,在新金分枝杆菌LY-2中单基因增强表达的基础上,构建hsd4A、pcc和vgb多基因组合表达质粒,并将其电转入敲除KasB基因的突变菌中,构建高产重组菌株LY-2-ΔKasB-hsd4A-pccvgb。植物甾醇转化结果表明,高产重组菌株的ADD浓度提高至4.97 g/L。以高产重组菌株LY-2-ΔKasB-hsd4A-pcc-vgb为研究对象,分别对培养基、助溶剂种类、甾醇与助溶剂的比例进行了优化。结果表明在新金分枝杆菌B发酵培养基中,ADD的浓度达5.46g/L;当在新金分枝杆菌B发酵培养基中添加与甾醇摩尔比为2的羟丙基-β-环糊精时,ADD的浓度高达6.4 g/L,且当底物投料量为15 g/L时,菌株的ADD浓度达9.7 g/L,是目前摇瓶上生产ADD的最高水平。