牛乳营养价值高,但作为其主要碳水化合物的乳糖导致全球70%以上人群对乳制品产生乳糖不耐受。β-半乳糖苷酶被广泛应用于低乳糖乳制品的制备。其中米曲霉（Aspergillus oryzae）来源的β-半乳糖苷酶（LACA）被认定为具有食品安全性,且具备催化活力高、胞外分泌强的突出优势,但其最适pH偏酸性,导致其在牛奶等中性低乳糖乳制品中的加工效率低。本文通过基因工程技术,在毕赤酵母（Pichia pastoris）中异源表达了GH 35家族中米曲霉来源的β-半乳糖苷酶;通过酶工程改造获得了最适pH提高的LACA突变体,其中两个突变体在牛奶乳糖水解的应用实验中表现出更高的乳糖水解效率,并解析了提高的原因;最后,通过胞内共表达抗氧化胁迫因子提高了β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的外源表达水平。主要研究结果如下:（1）将来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶基因经过密码子优化后克隆到表达载体p PICZαA上,转入毕赤酵母中,获得了表达β-半乳糖苷酶的基因工程菌,其摇瓶水平发酵上清液蛋白浓度达到1.1 mg·m L-1,酶活力达到298 OHA·m L-1。（2）设计了蛋白质表面电荷改造以及催化活性中心改造两种策略尝试提高LACA的最适pH。利用Rosetta在线服务器的Super Charge模块设计了10个突变位点来提高酶表面的净正电荷数,但未获得有效突变体;通过对最适pH不同的GH 35家族β-半乳糖苷酶进行序列及结构比对,选择催化活性中心位点Y138和Y364进行突变。结果表明Y138F、Y138V、Y138A和Y138L突变体均使得最适pH从4.5提升至5.5,Y364F突变使得最适pH提升至6.0。p Ka预测分析表明突变之后酸/碱催化残基E200的p Ka值从6.1提高至8.1左右,这与突变体最适pH提高相符。（3）在牛奶乳糖水解的应用研究中,当添加同等酶活力单位数的酶水解乳糖3 h后,Y138F和Y364F突变体分别水解60.3%和82.5%初始的乳糖,显著高于野生型（42.4%）和商品酶（52.7%）。Y138F和Y364F的产物抑制程度降低是乳糖水解效率提高的重要原因之一,测定了乳糖水解终产物半乳糖对β-半乳糖苷酶水解活力的抑制程度,结果表明Y138F和Y364F的产物抑制程度明显低于野生型。通过分子动力学模拟计算半乳糖与野生型、Y138F和Y364F的结合自由能,结果表明两种突变体对于半乳糖的亲和力明显下降,有利于产物半乳糖的释放,从而降低了对酶的抑制程度。（4）在毕赤酵母中共表达了10种内源协助因子,包括伴侣蛋白、抗氧化胁迫因子和热激转录因子,其中共表达抗氧化胁迫因子谷胱甘肽还原酶GLR1使得β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的表达量比出发菌株提高了22.2%。对表达乳糖酶能力最好的菌株X33-opt-GLR1-2进行3 L发酵罐发酵,表达量提升至摇瓶水平的11.2倍。