植物蛋白是一种可以媲美动物蛋白的优质蛋白质资源,营养价值高且具有多种生理功能,但植物蛋白在水解过程中容易产生苦味,在一定程度上限制了其在食品工业中的应用。羧肽酶是一种外切酶,可以作用在肽链或蛋白质的C端并逐渐水解释放游离氨基酸,因其可降低植物蛋白水解物的苦味而备受关注。本研究对羧肽酶基因进行挖掘和表达优化,旨在获得一种新的羧肽酶并应用于植物低聚肽的制备,以期降低苦味并强化其功能特性,为食品加工领域提供一种具有应用前景的羧肽酶。（1）根据NCBI数据库中Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus megatherium、Bacillus pumilus、Bacillus cereus的基因组,挖掘多个疑似羧肽酶的基因,通过PCR克隆获得20个基因片段,利用E.coli BL21（DE3）和B.subtilis WB600进行表达筛选。通过SDS-PAGE电泳分析和酶活测定,发现重组菌B.subtilis WB600/p MA5-cpm32表达的羧肽酶M32具有最高的羧肽酶活性,为1520 U·m L-1。重组羧肽酶M32具有一个肽酶M32家族的显著特征序列“HEXXE”,活性中心包含1个连接“H”和“E”的Zn离子结合位点,该酶与Priestia veravalensis羧肽酶的氨基酸序列相似性最高,为79.3%。（2）为了提高胞外羧肽酶M32的产量,分别采用融合信号肽、过表达转运动力蛋白Sec A和培养基及发酵条件优化三种方法。结果表明:融合信号肽Amy Q使胞外酶活从1520 U·m L-1提高至4233 U·m L-1,同时经培养基及发酵条件优化后,羧肽酶M32酶活最终可达5320 U·m L-1,较优化表达前提高了25.6%。纯化后的羧肽酶M32最适p H和温度分别为p H 8.0和60°C;0.1 mmol·L-1的金属离子Co2+和Zn2+可使酶活性分别提高至600.9%和334.6%;底物特异性研究表明,羧肽酶M32能切割C端除脯氨酸外的大部分氨基酸残基,对底物具有广谱性;动力学研究表明,Z-Phe-Tyr为最适底物,此时羧肽酶M32的Km值为0.6 mmol·L-1,kcat/Km值为82.2 L·mmol-1·s-1。（3）利用羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备低苦味大豆低聚肽和豌豆低聚肽并进行功能特性分析。与碱性蛋白酶制备的低聚肽相比,大豆低聚肽溶解性和水解度分别提高了18.6%和22.4%,豌豆低聚肽溶解性和水解度分别提高了37.4%和33.4%;大豆和豌豆低聚肽中分子量小于1 k Da的短肽含量均能达到80%以上;游离氨基酸分析表明羧肽酶M32对苦味氨基酸Met、Leu、Val、His和Arg具有偏好性,这些C端苦味氨基酸的脱除有利于减少苦味肽的平均疏水性,降低苦味;电子舌测定表明大豆低聚肽和豌豆低聚肽的苦味值分别降低了47.1%和22.8%,达到了较好的脱苦效果;抗氧化活性测试表明大豆低聚肽和豌豆低聚肽的DPPH自由基清除率分别提高了65.1%和23.9%,羟基自由基清除率分别提高了32.4%和25.1%。因此,结合羧肽酶M32的双酶法可以显著降低植物低聚肽的苦味并提高其功能特性,表明羧肽酶M32在植物生物活性肽制备中具有良好的应用前景。