【摘 要】
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原核蛋白表达系统以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表,是最具高收益的蛋白表达系统,具有易生长、低成本和高产的特点,但其分泌能力依然是目前面临的难点。通过扰动E.coli细胞壁,降低其结构稳定性,有利于重组蛋白分泌至胞外,降低蛋白纯化繁冗过程,提高蛋白正确折叠。D,D-羧肽酶DacA过量表达可促进E.coli胞外蛋白分泌水平,但也会对细胞生长具有显著抑制作用。研究中通过构建新型温度诱
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原核蛋白表达系统以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表,是最具高收益的蛋白表达系统,具有易生长、低成本和高产的特点,但其分泌能力依然是目前面临的难点。通过扰动E.coli细胞壁,降低其结构稳定性,有利于重组蛋白分泌至胞外,降低蛋白纯化繁冗过程,提高蛋白正确折叠。D,D-羧肽酶DacA过量表达可促进E.coli胞外蛋白分泌水平,但也会对细胞生长具有显著抑制作用。研究中通过构建新型温度诱导-trp操纵子调控系统TAT＿trp L＿dac A动态调控DacA表达水平,避免E.coli生长前期DacA过量表达对细胞生长的影响,具体主要内容如下:（1）构建了一个含有40个稳定期启动子的文库,用于筛选具有梯度表达水平的启动子。利用稳定期启动子替换删除lac I基因的质粒p RSFDuet-1-△lac I的T7启动子,以eGFP作为表征蛋白,检测其在E.coli生长过程中不同时期的eGFP荧光强度变化。筛选到5个具有梯度表达水平的启动子P41、P53、P84、P69、P25。（2）敲除E.coli BL21（DE3）基因组上原有的色氨酸合成酶基因簇trp EDCBA,基于稳定期启动子P53构建了新型trp操纵子系统并通过表征蛋白证明了该系统的可用性。通过温度诱导启动子,构建了一个新型温度诱导-trp操纵子调控系统TAT,通过不同培养温度实现了调控系统TAT的“打开”或“关闭”,成功调控了表征蛋白eGFP的表达。后期通过插入前导肽基因trp L,优化了构建的温度诱导-trp操纵子调控系统TAT＿P53＿dac A,构建获得调控系统TAT＿P53＿trp L＿dac A。（3）分别以eGFP和Amy K为模式蛋白,利用调控系统TAT＿Px＿trp L＿dac A构建的工程菌株,其eGFP和Amy K胞外生产水平显著提高,其中最高分别提高至对照菌株的22倍和8.8倍。上述工程菌株在高效生产胞外重组蛋白的同时,其细胞生长几乎不受DacA抑制作用的影响。含有调控系统的细胞在生长阶段形态没有发生显著变化,但重组蛋白高效分泌时,表面结构形成了透明的囊泡结构,这是重组蛋白高效分泌的主要原因。（4）细胞表面透性的增加会促进小分子底物及产物透过细胞膜。基于上述的调控系统TAT＿Px＿trp L＿dac A,分别以胺脱氢酶TM＿phe DH和7-α-羟基类固醇脱氢酶（7-α-HSDH）为模式酶,构建工程菌株验证温度诱导-trp操纵子调控系统TAT＿Px＿trp L＿dac A调控细胞壁膜通透性。小分子化合物（底物、辅酶等）进而透过细胞膜进入细胞与胞内的重组酶反应,实现全细胞催化的目的。其中,表达TM＿phe DH的全细胞对底物苄基丙酮的转化率最高达到87.9%;表达7-α-HSDH的全细胞对底物鹅去氧胆酸的转化率最高达到52.2%,但不含有温度诱导-trp操纵子调控系统的重组菌全细胞对上述两种底物没有任何催化作用,说明该调控系统在全细胞催化领域具有重要的应用潜力。
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