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口蹄疫(foot-and-mouth diease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性的偶蹄兽动物疫病,该病的发生可对经济及对外贸易造成极大影响。因而利用灭活疫苗对口蹄疫进行预防和保护,具有重要经济价值。我国目前国产的口蹄疫疫苗多为口蹄疫病毒灭活、配油佐剂制备而成,免疫副反应大,此反应大都由病毒抗原不纯引起。因此亟需优化改良口蹄疫病毒抗原的浓缩纯化技术,提升疫苗质量。GEM-PA表面展示系统是国外近年来研究发展起来的一种新型抗原制备技术。该系统由 GEM颗粒(gram-positive bacterial enhancer matrix particles)和锚钩蛋白 PA(protein anchor)构成。此项技术能够实现外源蛋白与PA融合后在GEM颗粒表面的展示。因此设计针对病毒抗原的纳米抗体并与PA进行融合,并在GEM颗粒表面展示,能够对病毒抗原进行浓缩纯化。本研究成功建立了 O型FMD灭活病毒的GEM纯化方法。利用纯化后的病毒抗原制备试验疫苗,初步评价其免疫效力,为今后研制高效的FMD疫苗奠定重要基础。本试验主要研究内容如下:试验Ⅰ 不同个数LysM基序的锚钩蛋白与GEM结合活性比较比较三种含不同个数基序锚钩蛋白PA的结合活性。首先应用PCR技术分别扩增得到含有1个、2个和3个自溶素基序(lysin motif,LysM)基因片段的PA、PA2与PA3;然后应用重组质粒pET-28a(+)-Nb构建原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL-21(DE3),进行诱导表达获得目的蛋白;最后将可溶性的PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb融合蛋白与GEM颗粒结合,经Western-blot、透射电镜与SDS-PAGE进行结合鉴定与结合活性比较分析。试验结果显示裂解后可溶性的融合蛋白PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb都能与GEM颗粒结合,PA2-Nb与GEM颗粒的结合活性明显好于PA-Nb,PA2-Nb的表达量和可溶性明显优于PA3-Nb,PA2-Nb与GEM颗粒的结合活性与PA3-Nb相当。因此PA2-Nb可作为下一步纯化口蹄疫病毒的最优接头蛋白。本研究可为进一步完善乳球菌外壳-蛋白锚钩展示系统提供理论基础。试验Ⅱ GEM-FMDV纯化系统基础构件的制备GEM颗粒制备:乳酸乳球菌MG1363用GM17培养基30 ℃恒温摇床振荡过夜,离心收集菌体,0.1 MHC1重悬,水浴煮沸30 min,离心洗涤3次,-80 ℃保存备用。透射电镜观察结果表明,获得的GEM颗粒保持原菌的形态大小,表面光滑,核酸蛋白已被完全除去。接头融合蛋白制备:该蛋白N端为FMDV特异性纳米抗体,C端为蛋白锚钩。将本实验室保存的载体质粒pET-28a(+)与pUC57-Pb双酶切后连接,获得重组锚钩-纳米抗体原核表达质粒pET-28a(+)-Pb,转化BL21感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,接头蛋白以部分可溶性蛋白形式表达,分子量32 kDa与理论值相符。GEM颗粒-接头蛋白复合物制备以及结合O型FMDV的初步鉴定:4 ml接头蛋白重悬1U GEM颗粒,室温30 min,离心收集沉淀。SDS-PAGE电泳结果显示GEM颗粒与接头蛋白结合存在于离心后的沉淀中;Western-blot结果显示GEM颗粒与接头蛋白的结合是特异性的;透射电镜观察表明,GEM颗粒与接头蛋白结合后,其表面有大量细小絮状物。将GEM-Pb复合物与O型FMDV结合,分离上清和沉淀进行初步鉴定。Western-blot鉴定发现GEM-Pb能够结合灭活的O型FMDV。试验Ⅲ GEM纯化O型FMDV方法建立及其免疫原性鉴定将GEM-Pb复合物与灭活的O型FMDV(ZK株)混匀,37 ℃孵育1.5 h,9000 rpm离心10 min,分别收集上清与沉淀。SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定结果表明GEM颗粒-接头蛋白复合物可特异性、高效地将FMDV固定在其表面,离心后上清中无病毒残留,沉淀中仅存在FMDV、接头蛋白和GEM颗粒,以及少量非特异性结合的杂蛋白。结合后的沉淀GEM-Pb-F与处理前的O型灭活FMDV 一样具有良好的反应原性,表明本试验成功建立O型FMDV的GEM纯化方法。纯化后获得的GEM-Pb-F复合物进行免疫小鼠试验和免疫猪试验,经液相阻断ELISA抗体检测和淋巴细胞增殖检测可以证实GEM-Pb-F复合物与处理前的FMDV相比抗体水平有显著提高,说明经GEM-Pb纯化后的灭活O型FMDV具有更好的免疫原性。