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RhoGTP酶家族是肌动蛋白骨架的关键调控因子,是一类GTP/GDP分子开关蛋白,结合GTP时为活化状态,结合GDP时为失活状态。RhoA是RhoGTP酶家族最具典型特征的成员之一。肿瘤抑制蛋白DLC1(Deleted in Liver Cancer 1)是RhoGAP(RhoGTPase-activating protein)家族成员之一,催化其下游靶蛋白RhoA从RhoA-GTP状态转变为RhoA-GDP状态,使RhoA失活。DLC1蛋白在细胞内不稳定,在多种癌症中低表达或缺失。一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)在细胞内发挥信号分子的功能,参与调控多种细胞信号转导途径。NO由一氧化氮合酶(NOS)合成,在细胞内通过诱导蛋白质亚硝基化(S-nitrosylation)调控一系列细胞生理进程。亚硝基化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰,通过一个NO基团与半胱氨酸残基上的反应性的硫醇基团结合,形成亚硝基硫醇(S-nitrosothiol)。有报道指出NO影响RhoA的活力。ROS调控成纤维细胞RhoA活力,该过程不依赖于RhoGEF或RhoGAP。ROS调控RhoGAP家族成员p190Rho-GAP和Cdc42GAP。黄酮(2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one),是黄酮类化合物的母核结构,抑制结肠癌和乳腺癌细胞增殖。已有报道指出,黄酮调控小鼠巨噬细胞和大鼠肝细胞内NO水平,影响斑马鱼胚胎、肝癌和结肠癌细胞内ROS水平,上调乳腺癌细胞DLC1的mRNA表达水平。本文探究了黄酮对乳腺癌细胞DLC1/RhoA信号通路的调控作用,黄酮对NO和ROS相关生理进程的影响及机制,以及黄酮对DLC1/RhoA信号通路的调控是否经NO或ROS介导。MTT和Hoechst-PI核荧光染色实验显示,黄酮以剂量和时间依赖性的方式抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡,但是不引起细胞坏死。黄酮上调两种乳腺癌细胞系DLC1蛋白表达水平。蛋白酶体抑制剂MG132处理提高了DLC1蛋白水平,蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理导致DLC1蛋白水平迅速降低,黄酮与CHX共同处理降低了DLC1的降解速率,说明黄酮抑制DLC1经蛋白酶体途径的降解,提高DLC1蛋白稳定性。黄酮抑制乳腺癌细胞NOS活力,该抑制作用依赖于完整的亚细胞结构。荧光显微术和流式细胞术两种方法的结果显示,黄酮降低乳腺癌细胞内NO水平。本文探究了黄酮对蛋白质亚硝基化的影响。基于“biotin-switch”法,将细胞内蛋白质所有亚硝基化位点标记上马来酰亚胺生物素(maleimide-biotin),再借助链亲和素磁珠纯化蛋白。实验结果显示,黄酮下调乳腺癌细胞内蛋白质亚硝基化修饰水平。为了探究黄酮抑制乳腺癌细胞增殖和上调dlc1的作用是否经no介导,在黄酮处理后,使用no供体硝普钠(snp)恢复被黄酮下调的no水平。经mtt实验检测发现,硝普钠在一定程度上逆转了黄酮对mcf-7细胞增殖的抑制作用,表明黄酮通过下调乳腺癌细胞内no水平抑制细胞增殖。而westernblot实验结果显示,no水平的恢复不影响dlc1的蛋白表达水平,证明黄酮对dlc1的调控作用不通过no介导。本文探究了黄酮对乳腺癌mcf-7和mda-mb-231细胞ros水平的调控作用,发现黄酮通过提高超氧化物歧化酶(sod)活力而降低细胞内ros水平。为了探究黄酮对dlc1/rhoa信号通路的调控作用是否经ros介导,本文使用过氧化氢处理,恢复被黄酮降低的ros水平。因为ros的作用具有浓度依赖性,癌细胞内ros处于生理水平时发挥信号转导分子的作用;而当ros水平过高时,ros将会造成细胞损伤和死亡。本研究的目的是探究生理范围内ros对dlc1/rhoa信号通路的调控作用,所以,首先对过氧化氢的使用浓度进行筛选,使过氧化氢将黄酮处理组细胞内ros水平恢复至接近对照组的水平。根据实验结果,选择使用40μm过氧化氢恢复被黄酮降低的ros水平。实验结果显示,150和200μm黄酮处理乳腺癌mcf-7和mda-mb-231细胞24和72小时,上调dlc1蛋白表达水平,过氧化氢抑制被黄酮上调的dlc1水平,表明黄酮通过下调ros而上调dlc1。pull-down检测显示,150和200μm黄酮处理mcf-7和mda-mb-231细胞24小时,抑制rhoa活力,而过氧化氢逆转了被黄酮下调的rhoa-gtp水平。划痕实验显示,黄酮对乳腺癌细胞迁移的抑制也被过氧化氢抵消。上述结果说明,黄酮通过下调乳腺癌细胞ros水平,进而调控dlc1/rhoa信号通路,抑制乳腺癌细胞迁移。本文证明黄酮抑制乳腺癌mcf-7和mda-mb-231细胞增殖,并诱导凋亡,上调dlc1蛋白表达水平,提高dlc1蛋白稳定性。黄酮通过抑制nos活力而降低细胞内no水平,进而下调蛋白质亚硝基化修饰水平。黄酮通过下调no水平抑制乳腺癌细胞增殖,而黄酮对DLC1的调控作用不经过NO介导。黄酮通过上调SOD活力而降低乳腺癌细胞ROS水平。使用外源过氧化氢处理恢复被黄酮下调的ROS水平后,黄酮诱导的DLC1蛋白表达水平的上调,以及对RhoA活力和细胞迁移的抑制均被过氧化氢逆转,说明黄酮对DLC1/RhoA信号通路的调控作用通过下调ROS介导。本文表明黄酮调控NOS/NO/S-nitrosylation细胞生物学进程并通过下调NO水平抑制乳腺癌细胞增殖,黄酮通过下调ROS调控DLC1/RhoA信号通路抑制乳腺癌细胞迁移。