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生物冶金是利用微生物或者微生物的代谢反应产物对矿石化学氧化或者生物氧化作用,使得矿石中难溶金属化合物以离子的形式溶浸到溶液中,再利用后续工艺回收金属的一种技术。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)是生物冶金过程中研究最为广泛的模式菌株。该菌是一种好氧化能自养细菌,可通过氧化Fe2+或还原态硫获得能量进行生长,存在于酸性矿山及含铁或硫的酸性环境中,被广泛应用于生物浸矿、工业废弃物中金属的回收、重金属污染的生物治理领域。群体感应(quorum sensing,QS)是一种细胞间的信息交流过程。当微生物群落周围的细胞密度和物种发生变化时,细菌能够集体改变行为,使细菌在低细胞密度(low cell density,LCD)和高细胞密度(high cell density,HCD)两种不同的基因表达状态之间切换。研究发现,密度感应系统广泛分布于革兰氏阴性菌中并且在许多生物过程发挥重要调控作用,例如:生物膜形成、毒力因子分泌、生物发光、抗生素的产生、孢子形成和DNA摄取等。研究表明,A.ferrooxidans中存在两套密度感应系统,第一套(QS-Ⅰ)是典型的LuxI/R类型,包括功能性基因afeI、afeR和未知功能基因orf3:afeI编码的AHL合酶可以合成AHL信号分子,afeR编码的AHL信号分子受体蛋白,是LuxR蛋白家族的转录调节因子。第二套(QS-Ⅱ)为非典型的QS系统,包含glyQ、glyS、gph、act基因,四个基因位于同一个操纵子中,分别编码氨基乙酸tRNA合成酶的α、β亚基,磷酸化酶,酰基转移酶,但是两套QS系统作用机理以及调控机制并不清楚。因此研究A.ferrooxidans中QS的调控机制,对于了解QS系统在该类极端菌代谢过程中的作用机理,阐明其适应极端环境的机制,具有重要的意义。为深入了解QS-Ⅰ系统中关键基因afeR的功能以及探索第二套非典型QS系统的生物学意义,本论文选择A.ferrooxidans QS中afeR和gph两个基因,研究它们在QS系统中的功能以及对A.ferrooxidans环境适应的作用和工业应用中的潜在价值。研究内容主要包括:(1)A.ferrooxidans QS启动子在不同能源条件下的转录水平研究。将QS中各基因的启动子与gusA报告基因融合表达,通过检测GusA酶活及RT-qPCR检测不同菌株内gusA转录表达能力,从而推测QS基因的启动子在不同环境中的活性。研究显示,在不同能源条件下afeI基因前启动子转录水平位于各基因之首。另外,与Fe2-能源相比,afeI启动子在S0能源条件下转录水平更高。(2)A.ferrooxidans QS-I中afeR基因的功能研究。在本实验室构建的A.ferrooxidansΔQS-I敲除菌株的基础上,通过基因回补方法构建了A.ferrooxidans afeR敲除菌株(ΔafeR),同时构建了afeR基因过表达工程菌株WT(pJRD215-Ptac-afeR)。通过测定afeR敲除、过表达菌株在不同能源条件的生长曲线、能量代谢、EPS合成以及生物膜形成等特征并利用RT-qPCR验证相关通路中基因的转录变化。研究表明当afeR基因过表达时对细菌具有调控作用:在50能源条件下可以促进细胞生长及能量代谢,促进EPS的合成以及生物膜的形成,在Fe2+能源条件下可以抑制亚铁氧化能力。(3)A.ferrooxidans中QS基因gph功能的初步探索。利用实验室构建的基因无痕敲除方法,构建gph基因的敲除菌株(Agph)和过表达菌株(WT(pJRD215-Ptac-gph))。测定分析gph突变菌株在不同能源条件的生长曲线、能量代谢、重金属抗性等特征,并且通过转录组学方法研究Δgph和(WT(pJRD215-Ptac-gph))在以S0为能源时基因的转录变化。研究发现,gph基因表达在S0能源条件下可以促进A.ferrooxidans细胞生长,并且可以增强Cu2+重金属抗性。在特定铜离子浓度刺激时可以促进铜抗性基因的表达抵挡重金属胁迫,转录组数据分析发现,gph基因在A.ferrooxidans的多个生命活动中发挥重要的调节作用,与细菌的分泌系统、双组分系统、ABC蛋白转运系统、脂多糖的生物合成、氧化磷酸化通路有密切的联系。总结而言,本论文较为全面的研究了A.ferrooxidans QS系统受体蛋白基因afeR和磷酸化酶基因gph的生物学功能,为进一步阐明QS的作用机理提供了重要基础数据。