研究目的:β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)假说在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病机制假说中占非常重要的地位。基于Aβ假说我们建立了AD转基因斑马鱼,发现斑马鱼脑微血管发生严重病变。为了探究Aβ与脑微血管病变的关系,以及脑微血管病变与神经元病变的关系,本文拟通过AD转基因斑马鱼及脑微血管内皮细胞模型进行研究。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)作为产生Aβ的唯一来源,希望通过深入研究APP和Aβ在脑微血管病变和神经元病变中的作用,以及脑微血管病变在AD发病中的作用,揭示脑血管保护在AD治疗中的重要作用。研究内容:(1)AD转基因斑马鱼模型的建立:利用斑马鱼appb启动子调控人APP瑞典型突变基因(APPsw),利用Tol2转座子系统,建立AD转基因斑马鱼模型,从基因和蛋白水平鉴定插入的人源APPsw的表达,通过行为学和病理学验证该APPsw转基因斑马鱼能出现AD样行为学和病理学变化。(2)选择不同月龄的APPsw转基因斑马鱼动态观察脑部病理学变化:病理学检测包括斑马鱼脑神经元和脑血管超微结构变化,斑马鱼脑神经元形态和数量变化,脑中Aβ1-42含量变化,脑内Claudin家族基因水平表达变化。(3)APP在脑微血管内皮细胞表达和功能研究:选择原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞和脑微血管内皮细胞株b End.3作为研究对象,从基因和蛋白水平检测APP的表达。建立过表达和敲低APP的细胞系,研究APP对微血管内皮细胞活性和细胞膜结构的影响;模拟脑内缺糖缺氧环境,建立脑微血管内皮细胞缺糖缺氧模型,从基因和蛋白水平检测APP的表达变化。研究结果:(1)AD转基因斑马鱼模型的建立:成功构建了p Tol2-appb-APPsw-CMV-EGFP表达载体,通过显微注射,荧光筛选,筛选出有荧光表达的斑马鱼品系。该品系斑马鱼荧光主要在脑血管内皮细胞、神经元、眼睛、心脏和躯干血管表达。采用PCR和Western-blot检测人源APP在斑马鱼体内的表达,利用胚胎整体免疫组化确定了APP的表达位置与EGFP荧光表达位置相同。T迷宫行为学检测发现12月龄转基因斑马鱼最后一次试验寻找目标区域营养富集区(EC区)的潜伏时间与首次试验的潜伏时间没有显著差异,而正常组和6月龄转基因斑马鱼最后一次试验潜伏时间比首次试验潜伏时间显著缩短(P<0.01)。进一步观察斑马鱼自发活动,结果显示12月龄转基因斑马鱼行为异常,与正常斑马鱼相比活动总距离增加,活动时间增加,寻找顶部的潜伏时间减少,上下探索次数显著增加(P<0.05),并且停留在顶部时间显著增加(P<0.05)。HE染色结果显示12月龄转基因斑马鱼端脑及皮质颗粒细胞排列疏松,细胞脱失严重;脑微血管周围出现明显空洞。Aβ1-42免疫组化检测Aβ1-42在脑内沉积,尤其是在血管和血管周围脑实质部位。以上结果提示我们成功建立了AD转基因斑马鱼模型,转基因斑马鱼能出现AD样行为和病理学变化。(2)选择不同月龄的APPsw转基因斑马鱼动态观察脑部病理学变化:利用透射电镜动态观察转基因斑马鱼神经元和脑血管超微结构变化,结果显示6月龄转基因斑马鱼脑血管结构开始改变:血管内皮细胞肿胀,染色质边缘化,血管周围线粒体、突触小泡等细胞器减少,基底膜不光滑;9-12月龄转基因斑马鱼血管结构改变更明显:血管内皮细胞皱缩,基底膜不光滑,出现增厚、断裂和松动现象,血管周围细胞线粒体,突触小泡等细胞器消失,出现空洞。9月龄转基因斑马鱼神经元结构开始改变:细胞形态不规则,核膜皱缩,线粒体皱缩,线粒体嵴长度变短,内质网肿胀;12月龄转基因斑马鱼脑神经元结构改变更明显:细胞核内容物出现崩解破坏,线粒体肿胀,线粒体嵴缺失,出现空化状。尼氏染色结果显示,9月龄转基因斑马鱼皮质和端脑内的神经元数量与正常斑马鱼相比减少,12月龄转基因斑马鱼皮质和端脑内神经元数量减少更显著(P<0.01)。Aβ1-42免疫组化结果显示3月龄转基因斑马鱼脑皮质有少量血管阳性染色,6月龄转基因斑马鱼皮质阳性染色血管增加,端脑中有少量血管有阳性染色。9月龄转基因斑马鱼皮质大部分血管都有阳性染色,有少量阳性斑块沉积在皮层和端脑。12月龄转基因斑马鱼端脑在血管周围出现大量阳性斑块。q RT-PCR检测claudin家族基因表达水平变化结果显示转基因斑马鱼脑内claudin-2,claudin-5b,claudin-k基因表达显著上调,claudin-5a,claudin-11a,claudin-11b,claudin-h基因表达显著下调,并与转基因斑马鱼年龄呈正相关趋势。以上结果提示6月龄转基因斑马鱼血管上出现Aβ沉积导致血管超微结构变化,随着年龄增加,Aβ沉积增加,血管结构被破坏,血脑屏障通透性改变,Aβ开始在脑实质沉积,影响神经元结构损伤,导致神经元细胞死亡。(3)APP在脑微血管内皮细胞表达和功能研究:采用PCR、Western-blot和细胞免疫荧光方法,从基因和蛋白水平检测APP在原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞和脑微血管内皮细胞株b End.3的表达。成功构建APP/APPsw过表达质粒pc DNA3-APP/APPsw-IRES-EGFP,以及sh RNA质粒p GPU6/m RFP/Neo-sh APP。通过脂质体转染b End.3细胞,采用荧光分选的方法筛选荧光表达细胞。利用PCR和Western-blot检测质粒转染效率。MTT检测细胞活力,结果显示敲除APP组细胞活力与NC组相比,细胞活力显著下降(P<0.01)。APP/APPsw过表达组细胞活力与NC组相比,无明显差异(P>0.05)。原子力显微镜观察转染后b End.3细胞的形态变化,发现敲除APP组细胞膜表面凹凸不平,细胞周围不规则,细胞表面高度显著增加(P<0.01)。建立b End.3脑微血管内皮细胞缺糖缺氧模型,MTT检测不同缺糖缺氧时间细胞活力变化。结果显示,随着缺氧缺糖时间增加,b End.3细胞活性降低,细胞大量死亡。利用q RT-PCR和Western-blot检测APP表达,结果显示缺糖缺氧16h和24h的b End.3细胞,与缺糖缺氧4h的细胞相比,APP表达水平增高,16h细胞差异具有显著性(P<0.05)。以上结果提示:脑微血管内皮细胞能够表达APP。敲除APP基因会影响微血管内皮细胞结构,影响细胞膜功能,导致微血管内皮细胞死亡。缺糖缺氧引起的微血管内皮细胞损伤会使APP蛋白和基因表达水平增加。结论:血管表达APP能产生的Aβ,Aβ可以在血管沉积引起血管结构改变,影响血脑屏障通透性,进而累及神经血管单元,引起神经元的结构破坏和细胞死亡。最终造成认知功能障碍,痴呆的发生。因此,脑微血管Aβ沉积过多造成脑微血管病变是AD发生的先兆或促进因素。提示减少Aβ在微血管的沉积以及改善和保护脑微血管功能,是延缓AD发生和发展策略的一个重要组成部分。