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缺血性中风是威胁人类生命和健康最严重的疾病之一,具有高发病率、高致残率和高致死率等特点。寻求切实有效的防治策略,开发新颖实效的防治药物,对缺血性中风的防治具有重要研究价值与临床意义。近年来,基于瘀血阻滞的病机认识,具有活血化瘀作用的三七及其制剂被广泛用于缺血性中风的防治。课题组前期研究也发现,三七超临界萃取物可抑制脑缺血后细胞内钙离子过量产生及对凋亡细胞具有神经保护作用,但作用机制尚不明确。阐明三七超临界萃取物的药理作用靶点,探讨其神经保护作用机制具有重要理论与现实意义。目的:研究三七SFE对大鼠脑缺血再灌注和PC12细胞Glu损伤模型的干预作用,通过考察三七SFE对PICK1蛋白、GluR2蛋白和PICK1/GluR2融合蛋白表达的影响,初步阐明三七SFE神经保护作用及机制。方法:采用改良的Longa线栓法构建脑缺血再灌注损伤大鼠模型,考察脑组织含水量、脑梗塞体积、海马组织细胞内钙离子浓度变化研究三七SFE的神经保护作用,采用RT-PCR技术、Western blot法和免疫共沉淀法考察三七SFE对PICK1蛋白、GluR2蛋白和PICK1/GluR2融合蛋白表达的影响;建立谷氨酸损伤PC12细胞模型,考察细胞形态、细胞存活率、细胞内钙离子浓度等变化研究三七SFE的神经保护作用;利用RT-PCR技术、Western blot法和免疫共沉淀法考察三七SFE对PICK1蛋白、GluR2蛋白和PICK1/GluR2融合蛋白表达的影响。GC-MS结合分子对接技术筛选三七SFE中活性成分抗PICK1蛋白的主要活性成分。结果:1.三七SFE对MCAO大鼠的保护作用（1）脑组织含水量和脑梗塞体积结果表明,与假手术组比较,MCAO模型组脑组织中的含水量显著增加（P<0.01）,脑梗塞体积显著增加（P<0.01）。与模型组比较,三七SFE(1.875、3.75、7.5 g·kg-1)组脑组织中的含水量显著降低（P<0.05、P<0.01）,脑梗塞体积明显降低（P<0.05、P<0.01）;（2）Fluo-3/AM荧光染色结果表明,与假手术组比较,MCAO模型组细胞内Ca2+浓度明显升高（P<0.01）。三七SFE(1.875、3.75、7.5 g·kg-1)组与模型组比较,细胞内Ca2+浓度呈剂量依懒性降低（P<0.01）;（3）RT-PCR和Western blot结果表明,与假手术组比较,MCAO模型组PICK1mRNA、GluR2 mRNA表达均显著降低（P<0.01）,PICK1蛋白、GluR2蛋白表达均明显降低（P<0.01）。与模型组比较,三七SFE(1.875、3.75、7.5 g·kg-1)组PICK1 mRNA表达显著降低（P<0.01）、GluR2 mRNA表达明显增加（P<0.01）,PICK1蛋白表达显著降低（P<0.01）、GluR2蛋白表达明显增加（P<0.01）;（4）免疫共沉淀结果表明,与假手术组比较,MCAO模型组PICK1/GluR2融合蛋白表达明显增加（P<0.01）,三七SFE(1.875、3.75、7.5 g·kg-1)组PICK1/GluR2蛋白表达显著降低（P<0.01）。2.三七SFE对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用（1）倒置显微镜观察,正常PC12细胞主要是梭形或多边形,贴壁牢靠,还可以看见类似神经突触的细胞突起。Glu模型组的细胞变圆、变小,贴壁能力大大减弱,细胞突起显著减少,甚至消失不见。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)组细胞密度增大,变圆细胞明显减少;（2）MTT和LDH结果表明,与正常组比较,Glu模型组的细胞存活率显著降低（P<0.01）,LDH活性明显增加（P<0.01）。与模型组比较,三七SFE(25、50、100 mg·L-1)组细胞存活率显著增加（P<0.05、P<0.01）,LDH活性显著降低（P<0.05、P<0.01）,并呈一定程度的剂量效应关系;（3）Hoechst 33342染色和结果表明,正常组的细胞凋亡较少,细胞核发出均匀的蓝色荧光。Glu模型组部分细胞呈浓染的碎块状,并发出高亮度的荧光,凋亡细胞明显增多（P<0.01）。与模型组比较,三七SFE(25、50、100 mg·L-1)组细胞核固缩现象减少,凋亡细胞也明显减少（P<0.05、P<0.01）;（4）Fluo-3/AM荧光染色结果表明,与正常组比较,Glu模型组细胞内Ca2+浓度明显升高（P<0.01）。与模型组比较,三七SFE(25、50、100 mg·L-1)组细胞内Ca2+浓度明显降低（P<0.05、P<0.01）;（5）RT-PCR和Western blot结果表明,与正常组比较,Glu模型组PICK1 mRNA、GluR2 mRNA表达均显著降低（P<0.01）,PICK1蛋白、GluR2蛋白表达均明显降低（P<0.01）。与模型组比较,三七SFE(25、50、100 mg·L-1)组PICK1 mRNA表达显著降低（P<0.05、P<0.01）、GluR2 mRNA表达明显增加（P<0.05、P<0.01）,PICK1蛋白表达显著降低（P<0.05、P<0.01）、GluR2蛋白表达明显增加（P<0.05、P<0.01）,三七SFE+FSC231组与FSC231抑制剂组PICK1 mRNA、GluR2 mRNA表达无明显差异（P>0.05）,PICK1蛋白、GluR2蛋白表达无明显差异（P>0.05）;（6）免疫共沉淀结果表明,与正常组比较,Glu模型组PICK1/GluR2蛋白表达显著增多（P<0.01）;与模型组比较,三七SFE(25、50、100 mg·L-1)组PICK1/GluR2蛋白表达明显减少（P<0.05、P<0.01）,三七SFE+FSC231组与FSC231抑制剂组PICK1/GluR2融合蛋白表达无明显差异（P>0.05）。3.GC-MS结合分子对接技术虚拟筛选三七SFE抗PICK1蛋白活性成分GC-MS技术共鉴定出三七SFE中26种化学成分,分子对接技术对26种化学成分与PICK1蛋白进行分子对接,以PICK1抑制剂FSC231的打分-15.87为阀值,筛选出6个打分高于FSC231的化学成分,依次为斯巴醇（-18.33）、人参炔醇（-18.01）、亚油酸（-17.89）、AO1（-16.07）、E,E,Z-1,3,12-十九碳三炔-5,14-二醇（-16.07）和（2E）-2-十二碳烯双酸（-16.02）。GC-MS结合分子对接结果显示,打分高的6个化学成分相对含量大于1.5%的为斯巴醇、人参炔醇和亚油酸。斯巴醇、人参炔醇和亚油酸与PICK1蛋白的作用模式以氢键和疏水作用为主。结论:1.三七SFE对缺血再灌注损伤大鼠和Glu损伤的PC12细胞有保护作用。2.三七SFE的保护作用机制可能与抑制PICK1蛋白和GluR2蛋白之间的相互作用、下调PICK1蛋白表达、上调GluR2蛋白表达有关。3.斯巴醇、人参炔醇、亚油酸是抗PICK1蛋白的主要活性成分。