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背景和目的:乙肝病毒x蛋白(HBx)被称为“病毒癌蛋白(viral oncoprotein)”,它促进了乙型肝炎病毒(HBV)相关的肝细胞癌的发展,但其确切机制未明。我们前期通过酵母双杂交、交配以及免疫共沉淀实验首次证实了线粒体内膜蛋白细胞色素C氧化酶亚单位III(COXIII)是HBx的体内结合蛋白。本研究将进一步探讨HBx与COXIII在线粒体中共定位及其对线粒体超微结构与功能的影响,探索HBx对HepG2细胞增殖能力的影响。方法:首先构建稳定表达HBx的肝癌细胞株HepG2/HBx,并以空载对照组HepG2/mock、空白对照组HepG2作为实验对照,利用激光共聚焦显微镜观察HBx与COXIII在线粒体中的定位。接着通过RT-PCR与Western blot法检测COXIII的mRNA与蛋白表达水平,酶动力学方法检测线粒体细胞色素C氧化酶(COX)的活性,流式细胞仪测量细胞内ROS和线粒体跨膜电位的水平,扫描电镜下观察HepG2/HBx细胞线粒体超微结构的改变。然后利用RT-PCR与Western blot法检测环氧合酶-2(COX-2)的mRNA与蛋白表达水平,加入ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后再检测COX-2的表达水平改变。采用CCK-8法和克隆形成试验检测细胞的增殖能力,接着加入COX-2的抑制剂NS-398后再次检测细胞的增殖能力改变情况。最后通过RT-PCR与Western blot法检测β–catenin的mRNA与蛋白表达水平,RT-PCR法检测β–catenin下游靶基因cyclin-D1以及c-myc的mRNA表达水平,并加入COX-2的抑制剂NS-398后观察HepG2/HBx细胞株β–catenin蛋白表达水平改变,再加入β–catenin的抑制剂XAV939后CCK-8法检测细胞增殖能力的改变。结果:成功构建稳定表达HBx的肝癌细胞株HepG2/HBx,激光共聚焦显微镜观察到HBx与COXIII在线粒体中共定位。HBx上调HepG2细胞COXIII转录后水平,增高COX酶活性、ROS水平以及线粒体跨膜电位。扫描电镜下观察到HepG2/HBx细胞线粒体稍肿胀。另外,HBx上调HepG2细胞COX-2的mRNA与蛋白表达水平,当加入ROS的清除剂NAC后,COX-2的蛋白表达水平下降。HepG2/HBx增殖能力增强,克隆形成率增高,当加入COX-2的抑制剂NS-398后,HepG2/HBx细胞的增殖能力下降。最后,我们检测到HBx能够上调HepG2细胞β–catenin的mRNA与蛋白表达水平,以及β–catenin下游靶基因cyclin-D1和c-myc的mRNA表达水平,加入COX-2的抑制剂NS-398后HepG2/HBx细胞株β–catenin蛋白表达水平下调,而当加入β–catenin的抑制剂XAV939后,HepG2/HBx细胞的增殖能力下降。结论:稳定表达的HBx能够与COXIII在HepG2细胞线粒体中共定位,上调线粒体的功能,增加ROS的水平来提高COX-2的表达,进一步上调β–catenin的表达水平从而促进细胞的增殖。