出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的主要产物鉴定及发酵工艺研究

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普鲁兰多糖(Pullulan),也叫茁霉多糖、普聚多糖或茁霉糖,是通过α-1,4和α-1,6糖苷键交替构成的聚合物。由于其具有如此独特的结构,使其在食品、化学工业、医药、烟草、化妆品、环境保护、农产品保鲜等方面有着非常广泛的应用。从普鲁兰多糖发酵液中可萃取分离出苯乙醇(也叫2-苯乙醇,2-PE)。后者最初是在桃子、梨、草莓、可可等天然植物中发现的,它具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气,是配制玫瑰香型食品添加剂、玫瑰香型香精的主要原料。因此,我国规定可用于各种食用香精和烟用香精中。本文研究结果也为生物法合成2-苯乙醇提供了新的菌株来源和一定的理论基础。本文基于研究获得可以生产分子量较高且无色素的普鲁兰多糖菌株,并进行菌株鉴定、多糖产物鉴定和产多糖发酵条件优化,旨在为工业上普鲁兰多糖发酵提供新的菌株来源。本文研究的主要内容和结果如下:1)本文从自然界以YPD固体培养基为筛选培养基,氯霉素为筛选压力,将曲利苯蓝作为筛选指示剂,获得一株产糖酵母菌株A5。根据形态学观察和ITS间隔序列分析对筛选出的酵母菌株进行鉴定,结果表明该酵母菌株与出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans YM24528和PR-23)的相似度达到99%,具有非常近的亲缘关系,可以确定其属于出芽短梗霉属。2)对这株出芽短梗霉菌株的胞外产物进行了结构的初步研究,主要利用普鲁兰酶酶解并结合薄层层析、红外光谱分析、核磁共振光谱分析以及凝胶渗透色谱对产物进行了结构的表征和分子量的测定。结果表明:该菌株产的胞外多糖为普鲁兰多糖,分子量为63.5 kDa。3)通过初筛和复筛的方法,最终获得一株能够生产分子量较高且无色素的普鲁兰多糖的菌株--出芽短梗霉A5。为了进一步提高胞外多糖的产量,采用单因素实验的方法,优化了该菌株发酵产普鲁兰多糖的培养基和培养条件:麦芽糖8%(w/v),酵母粉1%(w/v),蛋白胨2%(w/v),K2HPO4 0.5%(w/v),(NH42SO4 0.06%(w/v),CaCl20.03%(w/v),pH6,接种量7%(v/v);在获得的最佳的培养条件下摇瓶发酵生产无色素的普鲁兰多糖产量达到22.9 g/L,发酵罐发酵培养产量可达96.4 g/L。4)发酵生产普鲁兰多糖过程中同时产生一种清甜玫瑰样的香味。利用正己烷对发酵液进行萃取,再经过气相质谱联用仪定性后得知该香味物质是具有玫瑰香气的2-苯乙醇。然而2-苯乙醇本身对酵母细胞具有毒性作用,但探索发现菌株本身的发酵产物普鲁兰多糖可以提高酵母细胞对2-苯乙醇的耐受性。为了进一步提高2-苯乙醇的产量,获得了从发酵液中萃取2-苯乙醇具有极佳萃取效果的萃取剂-三烷基氧化磷(TRPO),并优化了萃取条件;对2-苯乙醇发酵培养基和发酵条件进行了筛选、优化。结果表明:该菌株在培养基1(麦芽糖2%(w/v),YNB 0.18%(w/v),KH2PO4 0.4%(w/v),MgSO4·7H20 0.04%(w/v),K2HPO4 0.5%(w/v),pH 6;L-苯丙氨酸4 g/L)且在最佳发酵条件下,通过发酵罐分批培养,最终获得2.6 g/L的2-苯乙醇。本文通过对出芽短梗霉菌株A5发酵产普鲁兰多糖和2-苯乙醇分别进行研究,结果对于进一步探究在同一个培养基条件下联产上述两种产物提供了理论基础,以及对于解除2-苯乙醇发酵过程中的毒性作用提供了新的策略。
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