论文部分内容阅读
牦牛是青藏高原的主要畜种,由于高原特殊的气候环境条件,放牧牦牛营养摄入受到牧草产量及营养价值季节性变化的制约,妊娠期和幼龄期营养缺乏导致生长迟缓牦牛发生率高,严重影响了牦牛养殖经济收益。瘤胃健康是反刍动物健康高效生长的基础,瘤胃上皮是营养物质吸收的主要场所,细胞连接是瘤胃上皮屏障功能的结构基础,在调节上皮营养物质高效吸收和免疫等过程中发挥重要作用。前人研究表明半胱胺和酵母具有促生长作用,然而其能否有效促进生长迟缓牦牛瘤胃发育和机体生长,以及其机理尚不清楚。因此,本研究首先比较生长迟缓与正常牦牛瘤胃发育和瘤胃上皮转录组关键差异基因及功能通路,而后考察添加半胱胺与酵母对生长迟缓牦牛生长性能、瘤胃微生物区系,以及瘤胃上皮关键差异功能通路中靶点基因表达的影响,阐明半胱胺和酵母通过瘤胃菌群及其发酵产物对上皮细胞连接等基因表达的差异影响,以期为丰富牦牛瘤胃健康营养调控理论,促进生长迟缓牦牛健康高效生长提供理论基础和试验依据。试验一生长迟缓与正常牦牛瘤胃发育及瘤胃上皮转录组差异研究根据本课题组前期研究牦牛群体体重与生长轴激素分泌的结果(Hu等,2016),按个体重处于同品种、同龄牦牛群体体重最低10%以下的标准(Jones等,2012),选取15月龄青海高原型生长迟缓牦牛10头(平均体重71.1±7.12 Kg),另选取接近群体平均体重的同品种、同龄正常牦牛10头(平均体重88.3±5.98 Kg),采血后进行屠宰比较瘤胃发育,并进行瘤胃上皮转录组分析,结果如下:(1)生长迟缓牦牛瘤胃、网胃、皱胃和空肠等消化道器官指数显著小于正常牦牛(P<0.05),且其瘤胃上皮乳头高度和肌层厚度显著小于正常牦牛(P<0.05)。生长迟缓牦牛瘤胃乙酸、丁酸和微生物蛋白(MCP)浓度显著低于正常牦牛(P<0.05),氨态氮浓度显著高于正常牦牛(P<0.05)。(2)生长迟缓牦牛血清血糖(GLU)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)浓度显著低于正常牦牛(P<0.05),尿素氮(BUN)浓度高于正常牦牛(P<0.05),LPS和促炎因子TNF-α与IL-2浓度显著高于正常牦牛(P<0.05)。(3)GO分析发现:生长迟缓牦牛瘤胃上皮上调基因主要富集于细胞外区域(Extracellular region)、细胞外基质(Extracellular matrix)、防御反应(Defense response)、免疫系统过程(Immune system process)、炎症反应(Inflammatory response)等功能分类;下调基因主要富集于物质跨膜转运载体活性功能分类,瘤胃上皮细胞结构、免疫和物质转运功能存在差异。(4)KEGG分析发现:生长迟缓牦牛瘤胃上皮与细胞连接作用的细丝蛋白(Filamin)、纤连蛋白(Fibronectin)、胶原蛋白(Collagen)等基因,以及上皮细胞连接负调控关键因子肌球蛋白轻链激酶(MYLK)、肌球蛋白9(MYL9)等基因表达较正常牦牛显著上调,富集到粘着斑(Focal adhesion)和细胞外基质受体相互作用(ECM-receptor interaction)功能通路;生长迟缓牦牛瘤胃上皮炎症相关的补体成分基因C2、C3、C7等,组织相容性抗原MHC基因等较正常牦牛显著上调,富集到补体及凝血级联反应(Complement and coagulation cascades)和抗原加工及呈递(Antigen processing and presentation)通路;生长迟缓牦牛瘤胃上皮离子及VFA载体相关的溶质载体(SLC26A3),氯离子通道(CLCN2)、阴离子载体(PAT1)等基因较正常牦牛显著下调,富集到矿物离子吸收(Mineral absorption)功能通路。以上结果表明,生长迟缓牦牛瘤胃发育不良和微生物发酵减弱,瘤胃上皮关键差异基因主要富集于细胞粘着斑、细胞外基质、补体及凝血级联反应、抗原加工及呈递和矿物离子吸收等功能通路,表明上皮细胞连接受损,存在炎症反应,营养物质吸收能力降低,阻碍机体生长。试验二半胱胺与酵母对生长迟缓牦牛生长性能及瘤胃微生物区系的影响在试验一基础上,按上述标准选取15月龄青海高原型生长迟缓牦牛30头(平均体重73.0±6.47 kg),随机分为3组,每组10头牛,分别设为基础日粮组(GRB),以及在此基础上的添加半胱胺组(GRBC)和添加酵母组(GRBY),饲养试验60天后进行4天消化试验,而后屠宰采样。结果表明:(1)添加半胱胺和酵母均显著提高生长迟缓牦牛平均日增重(ADG)、降低料重比(P<0.05),显著提高胴体重、屠宰率(P<0.05),促进瘤网胃发育(P<0.05)。半胱胺显著提高生长迟缓牦牛对日粮能量、中性和酸性洗涤纤维消化率(P<0.05),酵母显著提高生长迟缓牦牛对日粮能量和粗蛋白消化率(P<0.05),添加酵母促生长效果优于半胱胺。(2)半胱胺和酵母均显著提高生长迟缓牦牛血清GLU和TP浓度(P<0.05),酵母还显著提高了生长迟缓牦牛血清球蛋白(GLB)和免疫球蛋白Ig A和Ig G浓度(P<0.05),提高机体免疫,显著降低了LPS和促炎因子TNF-α、IL-2和IL-1β浓度(P<0.05),抑制炎症反应。(3)半胱胺和酵母均显著提高生长迟缓牦牛瘤胃总VFA浓度,降低氨态氮浓度(P<0.05)。半胱胺显著提高生长迟缓牦牛瘤胃乙酸浓度,提高乙酸与丙酸比例(P<0.05),促进乙酸型发酵;酵母显著降低生长迟缓牦牛瘤胃乙酸与丙酸比例(P<0.05),促进丙酸型发酵。(4)半胱胺和酵母均显著提高生长迟缓牦牛瘤胃产乙酸菌Saccharofermentans和产丁酸菌Butyrivibrio 2丰度(P<0.05)。此外,半胱胺显著提高了生长迟缓牦牛瘤胃Spirochaetes门,Lachnospiraceae XPB1014 group和Treponema 2属等纤维降解菌丰度(P<0.05),酵母显著提高产丙酸菌Prevotella 1、产乙酸菌Ruminococcaceae UCG-005和产丁酸菌Pseudobutyrivibrio属丰度(P<0.05)。以上结果表明,半胱胺和酵母均可促进生长迟缓牦牛生长,酵母促生长效果优于半胱胺。半胱胺主要通过提高瘤胃纤维降解利用菌群丰度,促进乙酸型发酵,提高日粮能量和纤维等消化率,促进生长。酵母主要通过提高瘤胃降解蛋白、淀粉的产丙酸菌,以及产丁酸菌群丰度,促进丙酸型发酵,提高日粮能量和蛋白消化率,并降低血清LPS和促炎因子浓度,缓解炎症反应,促进生长。试验三半胱胺与酵母对生长迟缓牦牛瘤胃上皮细胞连接基因表达的差异影响针对试验一转录组结果,进一步检测添加半胱胺、酵母对生长迟缓牦牛瘤胃上皮细胞连接、补体与凝血级联反应、抗原加工及呈递和矿物离子吸收功能通路中关键靶点基因表达的影响,通过相关性分析探索半胱胺与酵母通过瘤胃菌群及发酵产物VFA对上皮细胞连接等基因表达的差异影响。结果发现:(1)半胱胺与酵母均显著提高生长迟缓牦牛瘤胃上皮乳头宽度(P<0.05),半胱胺还显著提高瘤胃乳头表面积和肌层厚度(P<0.05),促进瘤胃发育。(2)半胱胺和酵母均显著提高生长迟缓牦牛瘤胃上皮矿物离子吸收通路中氯离子通道(CLCN2)和阴离子载体(PAT1)等离子及VFA载体基因表达(P<0.05),有助于营养物质转运吸收。此外酵母还主要降低了粘着斑通路中细胞连接负调控关键酶MYLK基因表达(P<0.05),上调了细胞连接CLDN1、OCLN和CDH1基因表达(P<0.05),促进上皮连接;并显著降低了瘤胃上皮补体及凝血级联反应通路中C2、C3和C7基因表达(P<0.05),以及抗原加工与呈递通路中MHCⅠ和Ⅱ基因表达(P<0.05),抑制炎症反应。(3)相关性分析发现瘤胃乙酸及丁酸浓度与上皮乳头宽度和表面积呈显著正相关(P<0.05),丙酸及丁酸浓度与上皮细胞连接OCLN、CLDN1和CDH1基因表达呈显著正相关(P<0.05),瘤胃Prevotella 1和Prevotellaceae UCG-001等产丙酸菌、Ruminococcaceae NK4A214 group和Ruminococcus 1等产乙酸菌,以及Butyrivibrio 2等产丁酸菌丰度与细胞连接和离子及VFA载体基因表达呈显著正相关(P<0.05),与介导炎症反应的补体成分基因表达呈显著负相关(P<0.05)。以上结果表明,添加半胱胺和酵母均可促进生长迟缓牦牛瘤胃上皮离子及VFA载体基因表达,促进营养转运吸收。酵母还可有效提高瘤胃上皮细胞连接基因表达,促进上皮连接,降低瘤胃上皮补体成分及组织相容性抗原基因表达,缓解炎症反应。半胱胺与酵母对瘤胃上皮细胞连接等基因的差异调控与其对瘤胃菌群及发酵产物的差异影响有关。综上所述,生长迟缓牦牛瘤胃发酵减弱、发育不良,上皮粘着斑功能通路中细胞连接关键负调控因子MYLK等基因上调,细胞外基质中破坏细胞连接的Collagen等基因上调,介导炎症的补体及凝血级联反应通路中补体C2、C3、C7等基因,以及抗原加工与呈递通路中MHC等基因上调,矿物离子吸收通路中SLC26A3、CLCN2、PAT1等离子及VFA载体基因下调,瘤胃上皮细胞连接损伤、存在炎症反应、营养转运吸收下降,导致牦牛生长迟缓。半胱胺主要提高了生长迟缓牦牛瘤胃上皮矿物离子吸收通路中SLC26A3、CLCN2、PAT1等离子及VFA载体基因表达,促进营养转运吸收,增加瘤胃上皮乳头宽度和肌层厚度,促进瘤胃上皮发育,提高日粮能量和纤维等消化率,促进生长,该作用与半胱胺提高生长迟缓牦牛瘤胃Spirochaetes门、Lachnospiraceae XPB1014 group和Treponema 2属等纤维降解菌群丰度,促进乙酸型发酵有关;酵母主要下调生长迟缓牦牛瘤胃上皮粘着斑通路中MYLK基因表达,增加OCLN、CLDN1和CDH1细胞连接关键基因表达,促进上皮细胞连接;下调介导炎症的补体及凝血级联反应通路中C2、C3和C7基因,以及抗原加工及呈递通路中MHC基因表达,并降低血清LPS和促炎因子浓度,抑制炎症反应;上调矿物离子吸收通路中CLCN2、PAT1等离子及VFA载体基因,促进营养转运吸收,促进瘤胃发育,提高日粮能量和蛋白消化率,促进生长,该作用与酵母提高生长迟缓牦牛瘤胃普雷沃氏菌等蛋白、淀粉利用菌以及丁酸弧菌等丰度,促进丙酸型发酵有关,且酵母促生长效果优于半胱胺。