植物病原棒形细菌的分子检测

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本世纪80年代以来,植物病原棒形细菌在农林业生产中的危害作用越来越多地引起了人们的重视。在这类细菌中,共包含八个检疫性有害生物,这些病害分布于美国、英国、法国和日本等多个国家和地区,均能通过种子或块茎等繁殖材料传播。病害防治、植物检疫等都需要对病原物进行快速而精确的检测。 本研究中选用16S-23S rDNA间的ITS序列的通用引物L1(5’-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’)和L2(5’-GTGCCAAGGCATCCACC—3’)对植物病原棒形细菌中的大部分种、亚种、致病变种,及部分腐生菌共14个菌种进行ITS分析,所有菌株(Cur.plantarum除外)均得到了一条分子量约为500bp的扩增产物。 对参试的14个植物病原棒形细菌的扩增片段进行片段回收、克隆和测序,将这些序列与数据库中已经报道的其它ITS序列进行同源性比较,在此基础上分别设计并合成了9个菌的特异性SCAR标记引物A1/A2、B1/B2、C1/C2、D1/D2、E1/E2、F1/F2、G1/G2、H1/H2、I1/I2。用以上9对引物分别对22个参试菌株进行PCR扩增。 引物B1/B2、E1/E2和I1/I2扩增结果:B1/B2、E1/E2和I1/I2能分别从目标菌Cur.f.pv.betae,Cur.luteum和C1.fangii中扩增出一条明显的分子量分别为387bp、390bp和350bp的产物,其余相应21个参试菌均无明显扩增主带;说明这三对引物具有很高的特异性,可以很简单快速地用于以上三个目标菌的检测。 引物F1/F2扩增结果:F1/F2可以从Cur.albidum目标菌Cur.pusillum中扩增出分子量明显不同的两个产物,其余20个参试菌均无明显扩增主带;所以在应用过程中只需根据产物的有无和产物分子量的大小,就能达到对目标菌Cur.pusillum的特异性的检测目的。 引物A1/A2、H1/H2扩增结果:A1/A2可以从Rathayibacter.tritici和目标菌Cur.f.pv.flaccumfaciens中扩增出分子量约为380bp的产物;H1/H2引物对可以从Arthrobacter ilicis和目标菌Rat.tritici中扩增出分子量约为400bp的产物,而Cur.f.pv.flaccumfaciens无扩增产物。所以使用这两对引物进行两次PCR反应可将目标菌Cur.f.pv.flaccumfaciens和Rat.tritici特异性地检测出来,或者通过一次PCR再辅助寄主范围和发病症状达到对目标菌的检测。 引物C1/C2、D1/D2和G1/G2的扩增结果:来自于Cur.f.pv.basellae的C1/C2、来自于Cur.f.pv.beticila的D1/D2和来自于Cur.plantarum的G1/G2可以从参试的多个菌中扩增出产物,所以以上三个菌的检测还需进一步优化PCR反应条件或重新寻找两者各自的特意性的引物。
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