研究背景宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)是最常见的子宫内膜病变之一,近年来宫腔粘连的发病率有逐渐升高的趋势,1.7%的继发性闭经及40%的不孕症患者均与宫腔粘连有关。宫腔粘连虽然不是恶性疾病,但是因其发病率逐渐增高,导致患者月经异常、剧烈腹痛及生育功能障碍,宫腔粘连不仅改变子宫内膜容受性,影响受精卵着床导致不孕,而且影响不孕症患者接受辅助生殖技术助孕后的效果,给患者及家庭带来身心及经济上的巨大损害,严重危害家庭及社会的稳定。目前国内外学者对于宫腔粘连的发病机制有多种假说,其中纤维细胞增生活跃学说及低雌激素状态学说得到多数学者的认可。雌激素是一种类固醇类激素,能促进子宫内膜增生,与雌激素受体相结合,就会发生变构从而形成二聚体,然后与ER反应元件相结合,激活基因的转录,翻译并合成蛋白质,刺激靶基因转录,促进子宫内膜和问质细胞的有丝分裂,引起子宫内膜基底层和功能层腺体、间质和血管增生和增厚,参与子宫内膜的增殖、修复,参与调节月经的周期性变化,并通过与多种细胞因子如MMPs、TGF、VEGF的调控来参与宫腔粘连的形成。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类依赖锌离子的蛋白水解酶,是构成细胞外基质降解最重要的蛋白水解系统,MMP-9属于MMPs中的第二大类-明胶酶,分子量为92Kda,是MMPs家族中分子量最大的酶,基因定位于20q11.2-q13.1,主要来源于巨噬细胞,可分解明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和X型胶原弹性纤维、破坏基底膜完整性,促进肿瘤浸润、转移、组织纤维化、慢性炎症和组织破坏等,是调节细胞的生长、迁移、浸润、炎症和血管生成的关键信号之一,同时在精细调控子宫内膜的周期性脱落和修复中也发挥作用。MMP-9减少后,蛋白水解酶活性降低,破坏了纤维蛋白溶解和合成的平衡,可引起细胞外基质在子宫内膜中过量沉积,子宫内膜被结缔组织替代,子宫内膜纤维化,导致宫腔粘连的发生。目的本研究的目的是应用免疫组织化学二步法技术通过研究正常子宫内膜组织、粘连组织旁子宫内膜组织及粘连组织中的雌激素受体(ER)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平,分析ER及MMP-9在各组织中的表达及相关性,试图在分子生物学角度寻找宫腔粘连的发生机制,并为宫腔粘连的临床治疗提供理论基础。方法1、标本的收集观察组：收集2011年6月至2014年6月在我院妇科住院行宫腔镜手术,术后诊断为中度宫腔粘连的患者30例,分别取其宫腔粘连组织及粘连组织周围正常子宫内膜组织。对照组选择同期因不孕症在我院住院行宫腔镜手术,术中宫腔镜检查未发现异常的患者30例,征得患者知情同意后取其少许正常子宫内膜组织。两组患者的年龄及孕产次均无统计学差异(P<0.05)。在本实验中为了减少不同等级粘连组织间的差异性对试验结果造成的影响,我们选取中度宫腔粘连组织作为研究对象,为减少不同月经时期对实验结果的影响,所有患者除闭经患者外手术均选择在月经干净第3-7天进行,术后病理结果回报为增殖期子宫内膜。2、手术方法所有患者除闭经患者外均于月经干净后3～7天进行手术,手术日前晚及手术日清晨分别予碘伏液冲洗阴道,并予200μg米索前列醇放置阴道后穹窿软化宫颈。采用奥林巴斯的被动式宫腔镜,所有的内镜器械均经环氧乙烷灭菌处理,予5%葡萄糖液作为膨宫液。麻醉选择静脉全麻及腰硬联合复合麻醉,常规手术消毒后予探针探查宫腔,宫颈扩张器逐步扩至9号半,缓慢将宫腔镜镜头插入宫腔,手术医生评估粘连程度后逐步分离粘连组织,使宫腔恢复大致形态,微型钳取出宫腔粘连组织及粘连组织周围正常组织,正常对照组以微型钳取少许正常子宫内膜组织,取出标本立即予10%福尔马林溶液固定。3、免疫组化获取的30例正常子宫内膜,30例宫腔粘连组织及30例粘连组织周围的子宫内膜组织的石蜡标本,连续切片。石蜡切片二甲苯脱腊,梯度酒精脱水(100%,90%,80%,70%),用PH7.4的PBS溶液冲洗后,切片浸入柠檬酸缓冲液中,加热沸腾后进行抗原修复。加入一抗(ER为上海基因科技有限公司,MMP-9为福州迈新生物科技有限公司)兔/鼠抗人雌激素受体、鼠抗人MMPs-9单克隆抗体,室温孵育60mmin；PBS冲洗后加入二抗(上海基因科技有限公司)室温孵育60mmin。随后再次PBS冲洗,DAB显色,室温孵育3-5min,光镜下控制显色,苏木精复染1分钟,1%酒精分化,蒸馏水冲洗返蓝5分钟,切片浸入梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脱水各2分钟,二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明后用中性树胶封片,显微镜下观察染色效果。4、结果判断(1)宫腔粘连判断标准轻度：粘连菲薄,粘连累及宫腔小于1/4,宫底和输卵管病变轻为轻度；中度：粘连形成,粘连累及宫腔小于3/4,宫底部分闭锁,无宫壁粘着,输卵管开口和宫腔上端部分闭锁为中度；重度：宫壁粘着,粘连累及宫大于3/4,宫腔闭锁,粘连带肥厚,输卵管开口和宫腔上端闭锁为重度。(2)免疫组化结果判断标准在显微镜下每张切片随机选择5个高倍镜视野,计算100个细胞/视野。结果根据阳性细胞所占比例及阳性细胞染色强度判定。结果判定：阴性(-,无染色),弱阳性(+,浅黄色细胞<50%或棕黄色细胞<20%),中度阳性(++,浅黄色细胞≥50%、20%≤棕黄色细胞<60%或深褐色细胞<30%),强阳性(+++,棕黄色细胞≥60%或深褐色细胞>30%)。5、统计分析采用SPSS13.0统计学软件对所有数据进行统计学分析。年龄、孕次比较用单向方差分析,组间ER及MMP-9比较用卡方检验,ER及MMP-9在各组织中的相关性采用Spearman等级相关检验。当P<0.05(双侧检验)表示差异有统计学意义。结果1、ER在所有组织中均有表达,在正常子宫内膜组织中的表达以强阳性(+++)为主,在宫腔粘连患者粘连组织旁的子宫内膜中的表达以中度阳性(++)为主,在粘连组织中的表达以阳性(+)为主。MMP-9在正常子宫内膜组织中的表达阳性率最高,其中以中度阳性(+)及强阳性(++)为主,在宫腔粘连患者粘连组织旁的子宫内膜中的表达以中度阳性(+)为主,在粘连组织中的表达以阴性(一)及阳性(+)为主。ER及MMP-9在各组间的表达差异有统计学意义(P<0.05)。2、ER的表达(1) ER在正常子宫内膜组织中的表达高于粘连组织旁子宫内膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)。(2) ER在粘连组织旁子宫内膜组织中的表达高于粘连组织,差异有统计学意义(P<0.05)。3、MMP-9的表达(1) MMP-9在正常子宫内膜组织中的表达高于粘连组织旁子宫内膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)。(2) MMP-9在粘连组织旁子宫内膜组织中的表达高于粘连组织,差异有统计学意义(P<0.05)。4、ER与MMP-9的关系(1) ER在正常子宫内膜和粘连组织周围子宫内膜组织中具有直线相关性,且呈正相关(r=0.436；p=0.016<0.05=)。(2) MMP-9在正常子宫内膜和粘连组织周围子宫内膜组织中具有直线相关性,且呈正相关(r=0.498；p＝0.005<0.05)。(3)粘连组织中ER及MMP-9不具有直线相关性(p>0.05)。结论1、ER在粘连组织旁子宫内膜组织及粘连组织中均呈低表达,且在粘连组织中的表达较粘连组织旁子宫内膜中表达更低,提示ER的低表达可能促进宫腔粘连的形成和发展。2、MMP-9在粘连组织旁子宫内膜组织及粘连组织中均呈低表达,且在粘连组织中的表达较粘连组织旁子宫内膜中表达更低,提示MMP-9的低表达可能促进宫腔粘连的形成和发展。3、ER与MMP-9在宫腔粘连发病机制中可能存在相关性,以此为基础,进一步探讨宫腔粘连的病因学,为治疗及预防宫腔粘连提供更加有效的方法。