目的：分析血红素氧合酶2(HO-2)在慢性肾衰(CRF)大鼠阴茎海绵体中的变化，探讨HO-2在阴茎勃起过程中的作用及与睾酮水平的关系，为进一步了解慢性肾衰性勃起障碍发生机制奠定基础。 方法： 1．CRF大鼠模型的建立：10周龄以上成年SD雄性大鼠30只，体重200-250g，随机分为两组，即实验组和对照组。实验前适应性饲养一周，自由进食饮水，一周后采用5/6肾切除构建CRF模型，麻醉采用腹腔注射2％戊巴比妥钠(50mg/Kg)，取侧卧位，肋弓下1cm斜切口，试验组首次行右侧肾脏2/3切除，一周后行对侧肾摘除术，术后8周进入慢性肾功能衰竭期，假手术组(对照组)同期在腹腔注射麻醉后只游离肾周，分离肾周脂肪后将肾脏复位，其余操作同手术组。CRF大鼠诊断标准为血清肌酐大于对照组2倍或大于120μmol/L。 2．电刺激海绵体神经(CN)诱发勃起：2％戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔麻醉，室温37℃，使用BL-410生物机能实验系统同步测量，右侧颈动脉插管检测颈动脉压，下腹部切口，于前列腺后外方找到海绵体神经，剥离阴茎皮肤至耻骨下，左侧海绵体使用相当于23号针头穿刺测量海绵体内压(ICP)，双极电极刺激海绵体神经，刺激参数：连续单刺激，频率12赫兹，脉冲5毫秒，刺激电压从1伏特到5伏特，每次刺激持续时间30秒，间隔5分钟后ICP平稳后增加1伏特，计算刺激后30秒内平均颈动脉压(MAP)及海绵体内压最大值(ICPmax)，通过ICPmax/MAP的比值来确定勃起障碍模型，经颈动脉取血测量睾酮。 3．取材：去除包皮及表面肉膜分离至白膜，游离大鼠阴茎海绵体，取阴茎干，去除尿道海绵体及背部血管，随后用过量麻药处死大鼠。使用生理盐水迅速清洗海绵体条，使用手术刀片截成四段，靠近耻骨联合的一段放入10％中性甲醛做免疫组化；向下取第二段，使用手术刀片和石蜡板进行切块及修块，分别取白膜、海绵体及神经，每个部位取两块标本，大小2mm×2mm×2mm，使用镊子移入PH 7.3的3％戊二醛固定；第三段进行免疫印迹分析，第四段留做RT-PCR，此两段均放于液氮中保存。 4．免疫组化：从形态学观察eNOS2在模型组和对照组中的变化。石蜡包埋，切片5μm厚：脱蜡、水化后PBS洗3次：滴加0.3％双氧水-甲醇，室温静置30分钟：PBS洗3次；高压修复5分钟；滴加正常羊血清蛋白封闭液40ul，室温15分钟，甩去多余液体：滴加Ⅰ抗(1:50)，4℃过夜，一抗为兔抗大鼠的多克隆抗体；4℃过夜后需在37℃复温45分钟；PBS洗3次；滴加Ⅱ抗(1:100)，37℃1小时，二抗为羊抗兔多克隆抗体；PBS洗3次；DAB显色5～10分钟，PBS冲洗10分钟后观察。 5．提取海绵体条中的总蛋白：根据中等强度裂解液说明书及分子克隆实验指南(第二版)进行操作，于无菌工作台内，取上清液分装，保存于-80℃超低温冰箱中。 6．使用Narodrop及BCA法测量蛋白浓度：一次性96孔板，使用Bio-Rad酶标仪空扫，寻找吸光度值接近或相同的孔，按照nanodrop、酶标仪以及BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行操作，向这些孔中依次加入浓度梯度的标准蛋白液及待测标本，待测标本稀释4倍，稀释液均为0.9％生理盐水，各孔体积均为20μL，各孔加入BCA工作液200μL，60℃，30分钟，使用NanoDrop测量各孔在562nm波长处的吸光度，首先用三蒸水进行调零，再进行标准曲线的绘制，最后测得样品的吸光度和浓度值，每孔均进行3次测量，取平均值。 7．免疫印迹：电泳转膜系统为GE公司迷你垂直电泳系统，使用ECL化学发光试剂盒及Bio-Rad Quantity One系统进行检测，将聚丙稀酰胺凝胶中蛋白转移至PVDF膜上后，可以清晰看见彩虹Marker10条带，使用考马斯亮蓝染胶脱色后确认凝胶中已无蛋白残留，丽春红可逆性染膜确认蛋白存在后加入封闭液室温侧摆摇床封闭60分钟，TTBS清洗后加入一抗(1：200)、二抗(1：2000)同前，内参为GAPDH(1：200，羊抗大鼠多克隆抗体)，HO-2一抗4℃侧摆摇床过夜后TTBS洗涤4次，每次15分钟，二抗侧摆摇床孵育室温60分钟，TTBS洗涤4次，同一张PVDF膜HO-2发光后，使用一抗二抗去除剂后，继续封闭，进行内参的检测，发光数据信号的读取采用条带、泳道法，以目的蛋白HO－2、内参GAPDH的比值进行比较。 结果：所有数据均采用均数±标准差表示，spss11.5软件进行统计，验证方差齐性后采用t检验及相关性分析。 1．ICPmax/MAP：3v，5v电刺激大鼠CN模型组(0.121±0.084，0.135±0.088)ICPmax/MAP显著低于对照组(0.263±0.147，0.244±0.089)，差别有统计学意义，α=0.05(双侧)，P<0.01。 2．血清睾酮比较：模型组与对照组的血睾酮浓度差别有统计学意义，对照组与模型组分别为223.388±143.242ng/dL及34.073±27.104ng/dL，Q=0.05(双侧)，P<0.01。 3．HO-2/GAPDH：免疫印迹分析海绵体中HO-2/GAPDH表达，模型组(0.510±0.397)显著低于对照组(2.672±1.72)，差异有统计学意义，α=0.05(双侧)，P<0.01。 相关性分析：海绵体中HO-2表达下降与血清睾酮下降存在相关性(r=0.902，α=0.05双侧，P<0.01)。 4．免疫组化：CRF组阴茎海绵体平滑肌和内皮细胞中的eNOS表达明显降低。 结论： 1．慢性肾衰组大鼠阴茎海绵体中HO-2与对照组有显著差别，CO/HO-2信号通路异常可能是CRF性ED发病机制之一。 2．慢性肾衰组大鼠睾酮水平显著低于对照组，且与海绵体中HO-2水平存在相关性，性激素水平的降低引起的NO/cGMP与CO/HO信号通路异常可能是CRF性ED发病机制之一。 3．CRF并发的尿毒症及高血压对神经和血管的影响可能是CRF性ED机制之一。 4．免疫组化结果表明海绵体平滑肌及内皮细胞中eNOS的降低可能是CRF性ED机制之一。