激活蛋白是从多种真菌中筛选、分离、纯化出的一系列新型蛋白质。对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫都有较好控制效果,并能提高作物的抗旱能力和提高作物产量,具有较好的应用开发前景。激活蛋白基因的克隆是构建高效工程菌菌株、研究作用机理、分析结构与功能域研究的重要基础,本文以激活蛋白产生菌—交链孢菌为材料,用基于λ噬菌体特异位点重组反应构建定向cDNA文库的Gateway^?新技术,首次成功构建交链孢菌cDNA入门文库和表达文库,进行基因表达与纯化研究,为交链孢菌的分子生物学研究提供了良好的遗传背景,同时为激活蛋白的结构与功能的进一步研究奠定基础。对揭示激活蛋白的作用机理以及蛋白药物的分子设计具有重要意义。 1.利用Gateway^?技术,首次成功构建了交链孢菌cDNA入门文库和表达文库。构建的cDNA入门文库经检测,入门文库的滴度达到6×10⁶,文库总容量为5.6×10⁷,其阳性克性率为100%,平均插入片段大小大约为1.53Kb。通过LR重组把入门文库转换为表达文库。表达文库的滴度为1.53×10⁶,文库总容量为6.2×10⁶,其阳性克性率为100%,平均插入片段大小大约为1.62Kb,为用激活蛋白抗体筛选文库克隆其编码基因提供基础。 2.成功地利用免疫学方法筛选Alternaria sp.菌株cDNA表达文库,筛选和克隆到一段包括起始密码子和终止密码子在内的882bp的完整编码序列,该核酸序列推测的氨基酸序列与已有的35kD蛋白的质谱测定所得肽段序列相比有较高的相似性。通过Blast检索未发现相似序列,认为该蛋白为一种新功能蛋白。 3.成功进行了激活蛋白基因的融合表达与纯化。用含T7启动子和His·Tag序列的pET-21b载体和BL21寄主菌高效表达了此基因的融合蛋白,并进行了亲和层析纯化。获得了分子量大小为32KD的融合表达蛋白。