论文部分内容阅读
目的:通过慢性不可预知温和应激(Chronic unpredicted mild stress,CUMS)大鼠模型检测豆腐果苷抗抑郁作用,并基于全转录组测序结果,从细胞水平探讨PNOC基因功能。方法:1.SD雄性大鼠60只,随机分为2组,正常对照组(Control)10只,慢性应激模型组(CUMS)50只,慢性应激模型组大鼠经过6周不同应激刺激后,随机分成慢性应激模型组、盐酸氟西汀(5mg/kg)和豆腐果苷组(32mg/kg、16 mg/kg、8 mg/kg),连续灌胃给药6周。除正常组外,每组大鼠均接受12周的慢性不可预知温和应激。采用蔗糖饮水实验、体质量测量、旷场实验、强迫游泳实验和Morris水迷宫等方法评定大鼠行为学改变,探讨豆腐果苷对CUMS模型大鼠行为学影响。2.培养大鼠胶质瘤C6细胞,利用LPS诱导细胞炎症模型,通过CCK-8实验检测LPS对C6细胞的毒性及挑选豆腐果苷最佳浓度,LPS刺激细胞24 h后,Q-PCR检测PNOC的表达及筛选干扰PNOC基因的最佳片段。利用转染试剂将siRNA干扰PNOC基因片段转入C6细胞,通过活性氧检测(ROS)细胞内其表达情况,酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子表达情况,Q-PCR检测GDNF的表达,Western Blot检测COX-2、iNOS、p-ERK、p-AKT和GFAP的表达,探讨PNOC基因在细胞炎症模型中的作用。结果:1.实验开始前,各组大鼠行为学检测无明显差异(p<0.05)。CUMS造模后,与正常对照组相比,慢性应激组大鼠体质量、蔗糖消耗量、水平运动距离、水平穿越格数、站立次数、穿越平台次数均明显减少(p<0.05),强迫游泳的不动时间、水迷宫的逃避潜伏期均明显升高(p<0.05)。与慢性应激模型组大鼠相比,豆腐果苷大剂量组及氟西汀组大鼠的体质量、蔗糖偏嗜度、水平运动距离、穿越格数、站立次数、穿越平台次数均明显升高(p<0.05),强迫游泳的不动时间、水迷宫的逃避潜伏期均明显降低(p<0.05)。2.在CCK-8实验中,2μg/ml的LPS对细胞无损伤作用(p<0.05),挑选了豆腐果苷最适浓度(100μM);Q-PCR结果显示,LPS诱导细胞炎症模型中,PNOC基因表达上升,而给予豆腐果苷能下调PNOC基因的表达(p<0.05)。经Q-PCR挑选siRNA-001为最佳干扰片段。免疫荧光结果显示,与空白对照组对比,经LPS刺激细胞后,GFAP荧光强度增强;siRNA沉默PNOC基因后GFAP荧光强度减弱。ROS实验中,LPS诱导细胞活性氧表达上升,siRNA沉默PNOC基因后降低活性氧的表达(p<0.05)。ELISA结果显示,与空白对照组对比,LPS诱导IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子表达上升(p<0.05);而siRNA沉默PNOC基因后降低了LPS的诱导细胞炎症模型中IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子的表达(p<0.05)。Western Blot结果表明,siRNA沉默PNOC基因降低了LPS的诱导细胞炎症模型中的COX-2、iNOS和GFAP的表达(p<0.05),增加了p-AKT和pERK的表达(p<0.05)。结论:1.慢性不可预知温和应激可诱导大鼠抑郁样行为,包括体质量下降、快感缺乏、自主活动降低、绝望程度增加、学习记忆能力下降等行为学改变,豆腐果苷可以改善慢性不可预知温和所应激导致的抑郁样行为,提高学习记忆能力,起到抗抑郁作用。2.LPS诱导细胞炎症模型中,siRNA沉默PNOC基因能明显降低ROS、GFAP、iNOS、COX-2及细胞因子的表达,提高GDNF的表达,表明siRNA沉默PNOC可能通过氧化应激、神经营养因子、细胞因子表达、ERK/AKT信号通路参与炎症反应;豆腐果苷能降低细胞炎症模型中PNOC基因的表达。