鼠疫耶尔森菌被普遍认为是可能用于生物战剂或生物恐怖的高致病微生物，同时，也存在肺炎型鼠疫在人类传播导致致死性肺炎的可能性。用于人群使用的鼠疫疫苗有两种，一种是用毒性鼠疫杆菌经甲醛处理而成的死菌疫苗，另一种是用减毒突变株EV76制成的减毒活菌疫苗。但死菌疫苗成本高，内毒素成分不确定，要求多次加强免疫，而且有不同程度的副作用，已经停止了使用。EV76是耶尔森鼠疫杆菌的无色素突变株，其毒性虽然大大减弱，保护效果比死菌苗好，但它仍有使实验鼠致病的毒性，EV76在人群使用，不同菌株的保护效果及副作用各不相同而受到质疑，因而开发新的鼠疫疫苗很有必要。最近已有不少鼠疫疫苗的研究报道，包括亚单位疫苗，DNA疫苗和重组减毒沙门氏菌载体疫苗。尽管以上列举的鼠疫疫苗策略都成功的被报道，但它们仍有许多不足之处，包括副作用，对吸入性鼠疫缺乏保护，需要频繁的加强免疫等。 本研究旨在研究一种全新的鼠疫疫苗，该疫苗要安全，廉价，并能刺激机体产生抗原特异性免疫保护反应，包括体液免疫反应、细胞免疫反应和粘膜免疫反应。另外，该疫苗要易于接种，以预防使用鼠疫杆菌发动生物恐怖袭击时，可以快速，大规模地自我接种。 通过在小鼠身上的实验研究发现，鼠疫耶尔森菌的F1蛋白和V抗原蛋白是其重要的保护性抗原。本研究共分三部分，从鼠疫杆菌的F1和V抗原基因着手，应用GEM颗粒疫苗系统和减毒李斯特菌载体疫苗系统用于开发理想的鼠疫疫苗。 第一部分：我们通过一种不含重组DNA，无繁殖能力的革兰阳性细菌菌体作为颗粒疫苗的核心(GEM)，通过锚蛋白与重组表达的鼠疫耶尔森菌F1蛋白和V抗原蛋白结合制成鼠疫二价颗粒疫苗，滴鼻接种免疫Balb/c小鼠(疫苗免疫小鼠剂量定为：2.5x109 GEM/20μg protein/dose)，检测该疫苗诱导机体产生高滴度抗原特异性抗体反应和抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN—γ的能力。实验证明该二价鼠疫颗粒疫苗安全无毒，无副作用，滴鼻接种能产生高滴度的抗原特异性抗体，包括粘膜保护性抗体，但抗原特异性细胞免疫反应较弱，为弥补该颗粒疫苗这一弱点，本研究通过在二价疫苗颗粒上同时结合上鼠疫杆菌的鞭毛素蛋白(革兰阴性菌的鞭毛素蛋白是TLR5的配体)，上调了该疫苗刺激机体产生抗原特异性细胞免疫反应的水平。 第二部分：利用减毒李斯特菌作为疫苗载体，能刺激机体产生较强的抗原特异性细胞免疫反应的特点，我们构建了分泌表达鼠疫F1和V抗原的鼠疫重组李斯特菌载体疫苗，滴鼻免疫接种Balb/c小鼠，检测该疫苗诱导机体产生抗原特异性抗体反应和细胞免疫反应的水平。本章重点介绍了PrfA突变李斯特菌株作为疫苗载体可以提高外源基因的表达水平，并提高了疫苗诱导产生的抗原特异性免疫反应。 第三部分：联合接种二价GEM颗粒疫苗和减毒李斯特菌载体疫苗两种鼠疫疫苗，通过同源性和异源性免疫接种策略(再次免疫时采用与初次免疫不同策略的疫苗)，研究其可否诱导机体同时产生强的细胞免疫反应和体液免疫反应，包括保护性粘膜免疫反应，使两种疫苗的优势互补。实验证明，初次免疫接种鼠疫减毒李斯特菌载体疫苗，加强免疫接种二价GEM颗粒鼠疫疫苗，可同时诱导出更强的抗F1、V抗原的细胞免疫和体液免疫反应包括粘膜保护性免疫反应。 本研究最重要的研究结果可概括为以下五点： (1)用GEM颗粒制作的鼠疫二价颗粒疫苗通过滴鼻接种，能诱导出高滴度的特异性体液免疫反应，包括粘膜保护性免疫反应。 (2)鞭毛素蛋白可以上调GEM二价鼠疫颗粒疫苗诱导产生的特异性细胞免疫反应。 (3)以减毒李斯特菌作为疫苗载体，鼠疫重组李斯特菌载体疫苗滴鼻接种，在脾脏和外周血单个核细胞中能诱导出很强的抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN—γ反应。 (4) prfA基因突变减毒李斯特菌株(Listeria△actA prfA*G155S)，可提高外源目的基因的表达水平，也可增强疫苗诱导的特异性细胞免疫和体液免疫反应。 (5)异源性免疫接种，即初次免疫接种减毒李斯特菌载体鼠疫疫苗，而加强免疫接种二价GEM颗粒鼠疫疫苗，可同时诱导出很强的抗F1、V抗原的细胞免疫和体液免疫反应包括粘膜保护性免疫反应。 本研究通过使用两个疫苗系统构建鼠疫疫苗，并分别对两个系统进行了改进，再联合使用两个系统的鼠疫疫苗滴鼻接种，小鼠实验证实能同时诱导出理想的细胞免疫反应，体液免疫反应和粘膜免疫反应。为最终开发出供人群使用的安全有效的鼠疫疫苗打下实验基础。同时，滴鼻接种途径方便用于快速大规模的自我接种，以应对可能的利用鼠疫杆菌发动的生物恐怖袭击。